海藻酸钠-明胶-鞣花酸共混膜的制备及特性

焦欣欣，赵 雷，王 凯，胡卓炎*

（华南农业大学食品学院，广东 广州 510642）

由于消费者不断地关注如何预防食品腐败，同时也慢慢倾向于使用天然的可降解生物材料，因此研究人员对天然大分子物质制备的膜材料越来越感兴趣[1]。涂膜保鲜有助于防止物理损伤、增强外观观赏性和减少微生物生长，可以成为一种节约成本的绿色保鲜方式[2]。可降解生物材料主要是蛋白质、多糖、脂质或这些物质的结合物[3]。在这些生物聚合物中，海藻酸钠具有良好的生物相容性和生物降解性，在Ca2+存在下形成凝胶，并在凝胶中捕获其他材料，可用于开发新型生物材料[4-6]。但是海藻酸钠有热稳定性较低和机械强度较差等缺点，现已有研究显示，海藻酸钠与其他聚合物混合可改善其性质[7]。明胶是具有良好的亲和力、兼容性、成膜性能[8]、机械性能和阻气性能的薄膜和涂层，可以在低相对湿度条件下具有良好的光学性能，能够用作生物包装材料[9]。海藻酸钠和明胶共混膜在食品领域已有应用于蔬菜、水果的保鲜研究，且可以通过添加抗氧化抑菌物质来提高海藻酸钠-明胶的保鲜效果[10]。

鞣花酸是一种天然的多酚类物质，广泛存在于多种药用植物及其果实中，具有良好的抗氧化、抗菌、抗衰老、抗癌症性能[11-12]。鞣花酸与壳聚糖制成的共混膜具有良好的机械性能和抗氧化抑菌性能[13]。Kim等发现鞣花酸质量分数分别为0.5%和1.0%的壳聚糖-鞣花酸膜通过诱导细胞凋亡对黑素瘤细胞具有明显的抗增殖作用，能显著抑制肿瘤组织和癌细胞生长[14-15]。

本研究采用溶液共混法，在海藻酸钠-明胶成膜体系中添加鞣花酸制备一种共混膜，通过评价共混膜的物理性能、抗氧化活性和抑菌性，为海藻酸钠-明胶-鞣花酸共混膜在果蔬涂膜保鲜中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

海藻酸钠（sodium alginate，SA） 河南思远生物科技有限公司；明胶（gelatin，G） 上海润捷化学试剂有限公司；鞣花酸（ellagic acids，EA）（分析纯） 上海阿达玛斯试剂有限公司；大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌由华南农业大学食品学院微生物实验室保存。

1.2 仪器与设备

UVmini-1240紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；MIR-254-PC电热恒温干燥培养箱 广州深华生物技术有限公司；SW-CJ-IFD洁净工作台 苏州泰安空气技术有限公司；LDZX-50KBS高压灭菌锅 上海宜川上岭仪表有限公司；Vertex傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）仪 美国BRUKE公司；Merlin高分辨场发射扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM） 德国Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1 共混膜的制备

据Liu Sijun等的研究，海藻酸钠和明胶的质量比在2∶1左右时共混膜的性能最优，但由于海藻酸钠成膜性差，通常在共混膜中加入甘油来增加共混膜的机械性能[7]。鞣花酸溶解性差，只溶于碱和吡啶。考虑到制备的共混膜拟用于食品保鲜，故选择0.1 mol/L NaOH溶液配制鞣花酸溶液。由预实验的结果得出，成膜性较好的条件是海藻酸钠、明胶、鞣花酸的质量比为10∶5∶3。称取质量分数为1.5%的海藻酸钠和明胶，加入蒸馏水，在60 ℃下磁力搅拌直至完全溶解，再用0.1 mol/L NaOH溶液配制质量分数为0.067%的鞣花酸溶液。将配制好的海藻酸钠溶液、明胶溶液、鞣花酸溶液按设计的比例混合在一起，加入质量分数1%的甘油，25 ℃下磁力搅拌30 min，用0.1 mol/L HCl溶液调节pH值。取20 mL共混膜液倒在培养皿中，干燥箱45 ℃干燥，冷却后揭膜，在25 ℃和相对湿度53%环境中平衡48 h。共混膜体系制备条件如表1所示。

表1 共混膜体系的制备条件Table1 Preparation conditions for different blended films

1.3.2 共混膜的特性分析

1.3.2.1 共混膜的厚度测定

根据汤秋冶等[16]的方法，共混膜的厚度通过手持式螺旋测微器测定，精度为0.001 mm。在膜上测定4 个顶点和中心点的厚度，取平均值即得膜的厚度。

1.3.2.2 不透明度测定

参考Li Jianhua[17]和石伟健[18]等的方法，在600 nm波长处使用紫外-可见分光光度计测定膜的吸光度。将样品切成矩形片（1 cm×4 cm）贴在比色皿表面，并直接放入分光光度计中进行测试，使用空的比色皿作为空白对照。以不透明度评价膜的光屏障性能，不透明度的计算按照公式（1）进行。

式中：A600nm为共混膜在600 nm波长处的吸光度；L为共混膜的厚度/mm。

1.3.2.3 水分质量分数和水溶性测定

采用质量损失法测定共混膜的水分质量分数和水溶性[19-20]。共混膜样品在相对湿度53%、25 ℃下平衡48 h，直到达到恒质量m1，在105 ℃的烘箱中干燥至恒质量m2。共混膜的水分质量分数的计算如方程（2）所示。

将膜样品放在30 mL蒸馏水中24 h，取出共混膜并擦去膜表面水分后，将残留的膜样品再次放入105 ℃的烘箱中干燥24 h，确定最终共混膜的干质量m3。共混膜水溶性的计算如公式（3）所示。

1.3.2.4 WVP测定

水蒸气透过系数（water vapour permeability，WVP）采用杯式法并略有改进[21]，膜片被固定在含3.0 g无水氯化钙（相对湿度0%）的小测试杯杯口，称质量后的测试杯被放入到装有饱和氯化钠溶液（相对湿度75%）的干燥器中，保持膜内、外两侧有一定的蒸汽压差，每隔1 d取出称质量一次，直至质量变化小于0.001 g，样品每组做3 次重复。按式（4）计算WVP。

式中：m为透过膜的水分质量/g；L为膜片的厚度/m；A为膜的有效面积/m2；t为水分透过的时间/s；ΔP为膜两侧水分蒸汽压差/Pa。

1.3.2.5 DPPH自由基清除率测定

参照Li Jianhua[17]和Samart[22]等的方法并稍作改动，称取0.1 g共混膜置于50 mL蒸馏水中浸泡2 h，制得共混膜浸泡液，将3 mL浓度为0.1 mmol/L的DPPH-乙醇溶液与1 mL共混膜浸泡液混合，将混合液放入暗室反应30 min，在517 nm波长处测吸光度。

式中：ADPPH为在517 nm波长处DPPH-乙醇溶液的吸光度；AS为在517 nm波长处共混膜溶液的吸光度。

1.3.2.6 抑菌性测定

以抑菌圈直径评价共混膜的抑菌性能，参照Liakos[23]和Nešić[21]等的方法并略作改动。将大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌分别接种到固体培养基中，在培养箱中37 ℃培养24 h。从培养皿中挑取单菌落，加入到20 mL液体培养基中，37 ℃、130 r/min摇床培养24 h。无菌水稀释10 倍后作为初始菌液。

吸取0.1 mL初始菌液加到固体培养基中，进行平板涂布。每个培养皿中均匀地放置3 个牛津杯（10 mm×7.8 mm×6 mm），并向牛津杯中加入0.15 mL配制好的共混膜液。把培养皿放入37 ℃的培养箱中培养24 h后，测量抑菌圈直径。

1.3.2.7 FTIR分析

收集方式为水平衰减全反射（attenuated total refraction，ATR）模式，ATR的晶体材料为ZnSe。用FTIR仪对共混膜进行FTIR扫描，扫描范围为4 000～600 cm－1，扫描次数32 次，分辨率4 cm－1。以空ATR晶体的FTIR谱图为背景。

1.3.2.8 SEM观察

将干燥后的膜样品喷金后，用Merlin高分辨场发射SEM观察共混膜的表面形貌。

1.4 数据分析

实验重复3 次，数据取3 次测定结果的平均值，利用Duncan’s新复极差检验评价样品平均值之间的差异显著性，以P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 共混膜的不透明度结果分析

图1 5 种不同共混膜体系的不透明度Fig.1 Opacity of five different blended films

食品保鲜膜通常需要保护食物免受光线的影响，不透明度高可增强膜的光屏障性能。由图1可以看出，在pH 9.0时，海藻酸钠-明胶-鞣花酸共混膜（D）的不透明度最高，为15.54；在pH 6.5时，海藻酸钠-明胶共混膜（A）的不透明度最低，为5.66；5 种混合膜的不透明度存在显著性差异。与海藻酸钠-明胶共混膜相比，添加鞣花酸可以明显改善共混膜的光屏障性能，这说明添加鞣花酸对共混膜的不透明度有显著的影响，可能是因为添加鞣花酸会使共混膜的颜色加深、结构更加紧密。pH值对共混膜的不透明度也有显著的影响，在碱性条件下，共混膜的不透明度较高。碱性条件和加入鞣花酸都会改变共混膜中氢键和氨基的作用，使共混膜的结构改变。

2.2 共混膜的厚度、水分质量分数、水溶性、WVP结果分析

表2 5 种不同共混膜体系的厚度、水分质量分数、水溶性和WVP Table2 Thickness, moisture content, water solubility and WVP of five different films

表2显示，5 种共混膜的水分质量分数在0.55%～0.85%之间，均没有显著差异。这是因为鞣花酸属于疏水性物质，其添加量对共混膜的水分质量分数没有显著性影响。在水溶性方面，5 种共混膜都具有较低的水溶性，在被水浸泡24 h后还可以维持共混膜的完整性。其中，pH 6.5的海藻酸钠-明胶共混膜（A）的水溶性最高，为0.91%；pH 9.0的海藻酸钠-明胶-鞣花酸共混膜（D）的水溶性最低，为0.38%。可能原因是海藻酸钠、明胶、鞣花酸能交联在一起，且海藻酸钠和鞣花酸都是疏水性物质，水分很难进入共混膜结构。WVP的结果表明，除pH 9.0的海藻酸钠-明胶-鞣花酸共混膜（D）WVP较低（0.74×10－10g/（m·s·Pa））外，其他4 种共混膜的WVP在（0.91～1.05）×10－10g/（m·s·Pa）之间且没有显著性差异。这可能与共混膜的厚度有关，共混膜D的厚度最薄。

2.3 共混膜抗氧化性结果分析

图2 5 种不同共混膜体系的DPPH自由基清除率Fig.2 DPPH radical scavenging activity of five different films

DPPH自由基清除率是测定抗氧化性能的重要手段。图2显示，以海藻酸钠-明胶为主的A、B膜样品的DPPH自由基清除率分别为4.39%和2.41%，说明海藻酸钠和明胶形成的共混膜抗氧化活性较差，改变pH值对其抗氧化活性影响不大。添加鞣花酸能提高共混膜对DPPH自由基的清除效果，其清除率最高可达到57.42%。这主要是因为鞣花酸本身就有很高的DPPH自由基清除能力和抑制脂质过氧化活性[24]，有研究表明，10 μg/mL鞣花酸的DPPH自由基清除率可以达到85%[25]。由于鞣花酸用0.1 mol/L NaOH溶液溶解，共混膜的碱性较大，因此采用0.1 mol/L HCl溶液调节共混膜的pH值。在碱性条件下海藻酸钠-明胶-鞣花酸DPPH自由基清除率高于55.00%；而在中性体系中，海藻酸钠-明胶-鞣花酸的DPPH自由基清除率只有20.44%，这是由于鞣花酸清除自由基的能力与苯氧自由基的稳定性呈正相关[26]，pH值会影响苯氧自由基与相邻的羟自由基发生交换的稳定性，从而影响其抗氧化活性。

2.4 共混膜的抑菌性结果分析

表3显示，5 种共混膜体系对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌均有抑制作用，对革兰氏阴性菌（大肠杆菌、沙门氏菌）的抑制作用较强。从对3 种细菌的整体抑菌性来看，鞣花酸的添加和pH值的改变对不同共混膜体系的抑菌性有不同的影响。共混膜对大肠杆菌的抑菌性能中，除了pH 10.8的海藻酸钠-明胶-鞣花酸共混膜（C）稍差外，其他4 组没有明显差异，抑菌圈直径在14.0 mm左右。共混膜对沙门氏菌的抑菌性能中，除了pH 7.0的海藻酸钠-明胶-鞣花酸（E）共混膜稍差外，其他4 组的抑菌性能没有显著性差异，抑菌圈直径在12.5 mm左右。原因可能与沙门氏菌生长的最适pH值为7.2～7.4，在中性条件下活性较高有关[27]。另外，pH 11.5的海藻酸钠-明胶共混膜（B）和pH 9.0的海藻酸钠-明胶-鞣花酸共混膜（D）对金黄色葡萄球菌的抑菌性能较好，抑菌圈直径为12.5 mm左右。形成以上结果主要有两个原因：在制作共混膜的过程中鞣花酸会有部分的损失；并且交联作用会使酚类物质在胶体中的扩散速率变慢[28]。此外，海藻酸钠和鞣花酸具有相似的抑菌机理，海藻酸钠利用—COONa和—OH类活性基团抑制细菌生长，鞣花酸通过络合菌体细胞的蛋白质和改变微生物生命活动需要的酶的分子结构抑制细菌生长并使细菌致死[29]。

表3 5 种不同共混膜体系的抑菌性能Table3 Antimicrobial activity of five different films

2.5 共混膜FTIR结果分析

图3 5 种不同共混膜体系的FTIR谱图Fig.3 FTIR spectra of five different films

由图3可知，5 种共混膜的FTIR谱图中都有海藻酸钠和明胶的特征吸收峰。其中，明胶中3 285 cm－1左右的宽吸收峰为—OH与—NH的伸缩振动吸收峰叠加造成的，海藻酸钠中1 404 cm－1左右的吸收峰是COO—的对称伸缩振动吸收峰，923 cm－1左右的吸收峰是羧酸中O—H的特征吸收峰。另外，1 640 cm－1左右的吸收峰是C＝O反对称伸缩振动吸收峰，1 553 cm－1左右的吸收峰是酰胺II带（—NH弯曲振动）的吸收峰，1 025 cm－1左右的吸收峰是C—O—C的伸缩振动吸收峰，这些吸收峰都是海藻酸钠和明胶吸收峰的叠加[30]。

在添加了鞣花酸后，从图3中曲线C、D、E可见，都出现了1 370 cm－1和1 077 cm－1左右的吸收峰，均为鞣花酸的吸收峰[30]。同时从图3可以发现，与膜样品A相比，碱性条件（B）和加入鞣花酸（E）都会使—OH与—NH的伸缩振动吸收峰向高波数移动，这说明pH值的改变和鞣花酸的加入会破坏海藻酸钠-明胶本身的氢键。与膜样品A相比，其他4 组中酰胺II带（—NH弯曲振动）的吸收峰强度明显减小且向高波数移动，说明明胶中的氨基发生了变化。这些结果都说明了鞣花酸可以成功地与海藻酸钠-明胶共混膜交联，与2.1节结论相同。

2.6 共混膜表面形貌和微观结构分析

图4 5 种不同共混膜体系的表面形貌Fig.4 Morphology of five different films

从图4可以看出，5 种共混膜的表面都较光滑、均匀，没有孔洞和间隙，且都有柔韧性。5 种共混膜的颜色有差异，从图4A、B可以看出，在酸性条件下，海藻酸钠-明胶共混膜呈透明白色，在碱性条件下颜色偏黄。从图4C～E可以看出，随着碱性减弱，海藻酸钠-明胶-鞣花酸共混膜的颜色由最初的明黄色逐渐加深，最后在中性条件下变成青色，这是因为在不同pH值条件下，鞣花酸溶液会有颜色的改变。

图5 5 种不同共混膜体系的SEM图（3 000×）Fig.5 SEM micrographs of five different films (3 000 ×)

SEM观察可以很好地了解共混膜的均匀性和微观结构。从图5中可以看出，5 种共混膜都很致密，没有任何颗粒状多孔结构，说明海藻酸钠、明胶和鞣花酸有一定的相容性。如图5A、B所示，海藻酸钠-明胶共混膜的表面形貌相对光滑、平整。但有少量气泡和褶皱，可能是由于在制作的过程中没有完全排除气泡，以及干燥的过程中突然失水发生共混膜皱缩造成。观察图5C～E，发现随着共混膜体系碱性减弱，鞣花酸与海藻酸钠、明胶的相容性相对变差。如图中箭头所示，在pH 10.8时海藻酸钠-明胶-鞣花酸共混膜可以形成很好的网络结构，pH 9.0时共混膜发生聚集现象，pH 7.0时共混膜已经出现了结块现象。但三者的微观结构都没有明显的相分离，表明了混合结构的完整性。共混膜的微观结构证实了海藻酸钠、明胶、鞣花酸在共混膜中具有兼容性和混溶性。

3 结 论

采用溶液共混法制备5 种以海藻酸钠-明胶为成膜基质的不同体系的共混膜并比较其特性。结果表明5 种共混膜都具有良好的光屏蔽性能、水蒸气阻隔性能和低水溶性、低水蒸气透过性等物理特性。鞣花酸的加入和pH值的改变可以提升共混膜的物理特性，其中pH 9.0的海藻酸钠-明胶-鞣花酸共混膜具有最高的不透明度（15.54）、最低的水溶性（0.38%）和WVP（0.74×10－10g/（m·s·Pa））。对于共混膜的功能特性，添加鞣花酸后共混膜的抗氧化性显著提高，pH 9.0的海藻酸钠-明胶-鞣花酸共混膜的DPPH自由基清除率最高，达57.42%。在抑菌性方面，添加鞣花酸对共混膜的影响不明显，且改变pH值对共混膜的抑菌性影响也不明显。膜结构方面，FTIR和SEM图显示鞣花酸可以与海藻酸钠-明胶共混膜交联，5 种共混膜的表面形貌都没有孔洞和间隙；但随着共混膜体系的碱性减弱，鞣花酸与海藻酸钠、明胶的相容性也相对变差。