兰坪虫草的缓解运动疲劳功能

孔 娜，虞 泓，张艳艳，葛 锋,3,*

（1.昆明理工大学生命科学与技术学院，云南 昆明 650500；2.云南大学中草药生物资源研究所云百草实验室，云南 昆明 650091；3.昆明市虫草生物资源开发利用工程技术研究中心，云南 昆明 650091）

疲劳是身体在高强度或长时间活动后，产生的一种生理或心理现象，表现为身体困倦、精神倦怠、注意力减退、工作效率下降，经常处于疲劳状态就会发展为病理性损害。通过有针对性的补充外源营养补剂或药物来缓解疲劳的发生，是解决疲劳的有效方法。因此在天然产物中寻找、筛选具有抗疲劳作用的有效成分、探究其作用机制具有重要现实意义[1-4]。

冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis）是名贵中药材，其生物活性物质包括多糖、核苷、麦角固醇和甘露醇等。冬虫夏草具有补肾益肺、抗炎、抗疲劳、抗氧化、抗肿瘤等药理作用[5]。兰坪虫草（Ophiocordyceps lanpingensis，OL）是一种寄生在钩蝠蛾幼虫上的虫草真菌，主要分布于我国滇西北地区，是近几年发现的线虫草属新种[6]。OL与冬虫夏草亲缘关系较近，富含虫草多糖、核苷类、甾醇类、氨基酸等多种活性物质，其主要成分在种类与含量方面与冬虫夏草相似，且易人工培养，具有替代冬虫夏草入药的潜力，研究开发OL具有重要的理论研究和实际应用价值[6]。目前，本实验室已实现OL的规模化培养[7]，为深入开展人工培养OL的活性成分以及功能研究提供了支撑。本实验依照《保健食品检测与评价技术规范》中有关抗疲劳功能的测定方案[8]，研究了OL菌粉的抗疲劳作用。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

SPF级雄性昆明鼠，质量18～22 g，购于辽宁长生生物技术有限公司，许可证号：SCXK（辽）2010-0001。

OL菌粉 云南云百草生物技术有限公司；西洋参云南向辉药业有限公司；0.5%羧甲基纤维素钠溶液生工生物工程股份有限公司。

血清尿素氮（blood uria nitrogen，BUN）测定试剂盒、血乳酸（blood lactic acid，BLA）测定试剂盒、乳酸脱氢酶测定试剂盒、肌酸激酶测定试剂盒、蒽酮试剂南京建成生物工程有限公司。

1.2 仪器与设备

Auegra x-22R高速低温离心机、LH750血液分析仪美国贝克曼库尔特有限公司；Ultrospec 2100pro紫外分光光度计 美国GE公司；XO-SM100超声微波组合反应装置 南京先欧仪器制造有限公司；HH-4水浴锅常州智博瑞仪器制造有限公司；DHG-9146A电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 OL有效成分的检测

OL菌粉D-甘露醇含量测定参照文献[9]：采用水提回流离心的方法，提取分离OL菌粉D-甘露糖，用高碘酸钠与甘露醇反应产生黄色物质，在412 nm波长处测定其最大OD值。甘露醇质量浓度在10～50 mg/L之间时，与OD412nm有良好的线性关系，以OD412nm为纵坐标，D-甘露醇质量浓度为横坐标绘制标准曲线，得回归方程为Y＝0.010 2X－0.003 1，R2＝0.999 6；多糖含量采用苯酚-硫酸法[9-10]测定：以葡萄糖为对照品，取供试品溶液0.2 mL至具塞试管中，加入1 mL体积分数6%重蒸苯酚、5 mL浓硫酸，混匀，室温放置10 min，40 ℃水浴15 min，冷却至室温，摇匀，在490 nm波长处测定吸光度，以吸光度Y为纵坐标，葡聚糖质量X为横坐标绘制标准曲线，得回归方程为Y＝0.011 5X－0.003 8，R2＝0.999 5，用上述方法测定样品中多糖含量；黄酮含量采用Al(NO3)3-NaNO2-NaOH显色法[11]测定：分别加入芦丁标准溶液1、2、3、4、5 mL于5 支15 mL的刻度试管中，然后加入0.3 mL质量分数0.5%的NaNO2，静置6 min。加入4 mL NaOH溶液，最后用蒸馏水定容至10 mL，在室温条件下反应15 min后，于510 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，黄酮浓度为横坐标绘制标准曲线，建立回归方程Y＝0.001 2X－0.009 8，R2＝0.999 6，用上述方法测定样品黄酮含量；腺苷含量通过建立高效液相色谱法[12]测定：采用ACCLAIM C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）；柱温30 ℃；流动相甲醇-水（体积比15∶85）；流速1.0 mL/min；紫外检测波长260 nm，制备标准液注入液相色谱仪中，以进样量为纵坐标，峰面积为横坐标绘制腺苷标准曲线：Y＝0.021X。制备样品溶液注入高相液相色谱仪中，测定腺苷浓度。

1.3.2 动物分组与灌胃

实验小鼠饲养条件：温度18～22 ℃、相对湿度50%～55%，自然光照，自由饮水。小鼠给予基础饲料饲养一周，小鼠随机分为5 个实验组，每组10 只，分别为OL低剂量组（OLL组，OL灌胃剂量450 mg/（kg·d））、中剂量组（OLM组，OL灌胃剂量900 mg/（kg·d））、高剂量组（OLH组，OL灌胃剂量1 800 mg/（kg·d））以及空白对照组（BC组，灌胃蒸馏水900 mg/（kg·d））、阳性对照组（AG组，西洋参灌胃剂量600 mg/（kg·d）），每周称体质量一次，根据小鼠体质量给予不同剂量的受试物，连续灌胃30 d。称取10 g OL菌粉溶于100 mL质量分数0.5%的羧甲基纤维素钠溶液，4 ℃冰箱保存。连续灌胃30 d。给药期间记录小鼠初始体质量和终末体质量，并每周记录小鼠的摄食量。

1.3.3 负重游泳实验

小鼠负重游泳实验末次给予受试药物30 min后，将鼠尾根部负荷其体质量5%的铅皮，置小鼠于游泳箱（50 cm×50 cm×40 cm）中游泳，水深30 cm，水温25 ℃，记录小鼠自游泳开始至死亡的时间（小鼠鼻孔10 s内不能浮出水面），即小鼠负重游泳时间。

1.3.4 BUN浓度、乳酸脱氢酶等指标的测定

小鼠末次给予受试药物30 min后，将小鼠放于游泳箱中不负重游泳90 min，休息60 min后小鼠摘眼球取血，置于4 ℃冰箱约3 h。血液凝固后，血液样品以3 000 r/min离心10 min分离血清，取血清备用。用试剂盒测定BUN浓度，乳酸脱氢酶、肌酸激酶活力及血糖浓度。

马太太笑道：“易先生你太太不像你说话不算话，上次赢了不是答应请客，到现在还是空头支票，好意思的？想吃你一顿真不容易。”

1.3.5 BLA浓度的测定

小鼠末次给予受试药物30 min后，将小鼠放于游泳箱中不负重游泳10 min，水温（30±1）℃，并于游泳前、后立即休息20 min，然后用毛细管眼球内眦部取血20 μL。用乳酸试剂盒测定BLA浓度，并计算BLA曲线下面积，即BLA曲线下面积＝5×（游泳之前BLA浓度+3×游泳后0 min的BLA浓度+2×游泳后休息20 min后的BLA浓度）。

1.3.6 肝和血浆中抗氧化参数的检测

将1.3.4节小鼠脱颈椎处死，摘眼球取血（加抗凝剂），用于血液生化指标检测。取肝脏经生理盐水漂洗后滤纸吸干，取组织块用冰冷的生理盐水匀浆制备体积分数10%组织匀浆，利用抗氧化酶试剂盒测定抗氧化酶活力。

1.3.7 LG含量测定及血液参数指标的检测

小鼠肝糖原（liver glycogen，LG）的含量利用蒽酮试剂测定。末次给予受试物30 min后脱颈椎处死，取肝脏经生理盐水漂洗后滤纸吸干，精确称取肝脏0.1 g于离心管中，加入质量分数5%三氯醋酸8 mL，每管匀浆1 min，匀浆离心得上清液，取上清液1 mL，然后加入体积分数95%的乙醇溶液4 mL，室温下竖立放置过夜。沉淀完全后，3 000 r/min离心15 min获得沉淀物，加入2 mL蒸馏水溶解沉淀物，再加入蒽酮试剂，在所有离心管达到室温后，将其浸入沸水浴15 min后，然后移入冷水浴。将离心管内液体移入比色管，使用分光光度计在620 nm波长处检测吸光度。计算糖原含量并进行统计分析；脱颈椎处死时取血加抗凝剂利用LH750血液分析仪检测血液参数指标。

1.4 数据统计分析

数据处理和统计分析采用Excel和SPSS 20.0软件，各组间数据采用方差分析，按方差程序先进行方差齐性分析检验，方差齐用Duncan方法计算F值比较各组间的差异性，方差不齐用Dunnett’s T3及非参数检验统计学处理比较各组间的差异有无显著性，P＜0.05认为差异显著，数据表示为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 OL对小鼠体质量和摄食量的影响

表1 OL对小鼠体质量的影响（n＝10）Table1 Effect of OL on body mass of mice (n= 10)g

表2 OL对小鼠摄食量的影响（n＝10）Table2 Effect of OL on food intake of mice (n= 10)g

2.2 OL有效成分含量

通过测定，发现OL的D-甘露醇、黄酮、多糖和腺苷含量分别为（25.65±10.42）、（0.98±0.20）、（46.46±19.76）mg/g和（451.61±125.42）μg/g。已有研究表明，黄酮具有自由基抑制活性，能增加机体的抗疲劳能力[13]，多糖是一种广泛存在于天然产物中的大分子物质，具有广泛的药理学活性[14]，并具有增强机体抗疲劳的能力[15]。

2.3 OL对小鼠负重游泳时间的影响

图1 OL对小鼠负重游泳时间的影响（n＝10）Fig.1 Effect of OL on weight-loading swimming time of mice (n = 10)

运动耐力的提高是抗疲劳能力加强最有力的宏观表现，游泳时间的长短可以反映动物的疲劳程度。如图1所示，OLL、OLM、OLH组和AG组负重游泳时间与对照组比较明显延长（P＜0.05），分别延长了47.4%、70.5%、71.7%和68.0%。说明OL能延长小鼠游泳时间，提高小鼠运动耐力，延缓疲劳发生。

2.4 OL对小鼠相关疲劳生化指标的影响

疲劳产生的重要原因是能源物质的消耗和代谢物质的积累[16]。常用的疲劳评价方法主要有两个：运动耐力实验和生化指标检测。在反映疲劳的生化指标中，BUN浓度、BLA浓度、LG含量等的改变具有代表性，也是检测疲劳最常用的指标[17]。BUN作为蛋白质和氨基酸的代谢产物，是评定机体对运动适应能力的重要指标之一，当机体长时间活动不能通过糖和脂肪分解代谢得到足够的能量时，机体蛋白质和氨基酸分解代谢随之增强，血清BUN浓度随运动负荷的增加而增加。

图2 OL对小鼠血液生化指标的影响（n＝10）Fig.2 Effect of OL on blood biochemical indices of mice (n = 10)

由图2A可知，OLM组和OLH组BUN浓度与BC组相比显著降低（P＜0.05），说明OL能减缓剧烈运动中蛋白质的过量分解，提高机体对剧烈运动的适应能力[18]。LG是重要的能源物质，机体血糖浓度降低时可迅速分解释放入血液中，以维持血糖水平的稳定[19]。实验结果表明，OLH组和AG组LG含量与BC组相比显著升高（P＜0.05，P＜0.01），说明OL能为机体提供能量来达到抗疲劳的目的。乳酸脱氢酶通常存在于肌细胞中并能释放入血液中，乳酸脱氢酶氧化释放乳酸并改变pH值，导致肌肉损伤。因此，乳酸脱氢酶可以作为检测疲劳的指标[20]。BLA是碳水化合物在厌氧条件下糖酵解的产物，持续运动会导致过量BLA的生成和积累，诱导身体产生疲劳。BLA的积累会导致血液pH值降低，危害各种器官进而导致疲劳[22]。如图2B所示，OLM、OLH、AG组乳酸脱氢酶活力显著低于BC组（P＜0.05），能有效抑制运动后BLA的产生，增强小鼠运动耐力。说明适量OL能够调控BLA和乳酸脱氢酶的水平。血清肌酸激酶活力是评价骨骼肌损伤的一个重要指标，过度运动会对肌组织造成一定的损伤，导致肌酸激酶活力升高[21]。如图2C所示，OL能够显著降低游泳小鼠肌酸激酶活力（P＜0.05）。

表3 OL对小鼠血液乳酸的影响（n＝10）Table3 Effect of OL on blood lactic acid level of mice (n= 10)

如表3所示，OLM、OLH、AG组与BC组比较，小鼠运动前后BLA浓度显著降低（P＜0.05）。OLL组也能一定程度上降低小鼠体内BLA浓度，但与BC组相比，无显著性差异。说明适当剂量的OL具有抑制运动过程中BLA浓度升高的作用，对缓解疲劳有一定帮助。

2.5 OL对小鼠肝脏和血液氧化应激参数的影响

剧烈运动过程中，能量高消耗会引起氧化系统和抗氧化系统的失衡，导致活性氧的增加和抗氧化剂的减少，骨骼肌活性氧过剩，最终引起外周疲劳[23-25]。人吸氧量的2%～3%经过新陈代谢会转化为氧自由基。一方面，氧自由基作为信号分子，参与正常的生理过程；另一方面，过量的氧自由基能引起氧化应激、细胞损伤和肌肉疲劳[26]。为维持体内平衡，过量的氧自由基需要抗氧化剂清除，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和过氧化氢酶（catalase，CAT）是重要的清除自由基和代谢产物的抗氧化酶。SOD对机体的氧化和抗氧化平衡起着至关重要的作用，它能清除超氧阴离子自由基以保护细胞免受损伤[27]。

由表4可知，在肝脏中，AG组SOD活力极显著高于BC组（P＜0.01），OL各剂量组SOD活力显著高于BC组（P＜0.05）；OLM和AG组能显著提高CAT活力（P＜0.05）。同时，在血液中，OL各剂量组均能显著提高SOD活力（P＜0.05），OLL组和OLM组能显著提高CAT活力（P＜0.05）。说明OL有可能通过提高机体SOD和CAT活力，增加抗氧化能力，进而减少自由基的积累，加速体内脂质过氧化物的及时清除，增强小鼠运动耐力和抗疲劳作用。

表4 OL对小鼠肝脏和血液抗氧化指标的影响（n＝10）Table4 Effect of OL on liver and blood antioxidant indices of mice (n= 10)

丙二醛（malondialdehyde，MDA）是一种脂质过氧化产物，是评估细胞氧化应激的重要指标。机体在代谢过程中产生自由基，自由基能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化物。通过测定MDA含量可以反映机体脂质过氧化的程度，间接表明细胞损伤的程度[28]。肝脏中，OLM组和OLH组MDA含量极显著低于BC组（P＜0.01），AG组MDA含量与BC组比较也有显著性差异（P＜0.05）。血液中，OLM组MDA浓度与BC组比较也有显著性差异（P＜0.05）。以上研究结果表明，OL可以减弱运动过程中的细胞氧化应激反应，降低脂质过氧化程度，维持细胞正常生理功能，从而体现抗疲劳作用。谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）催化过氧化氢分解的关键酶，广泛存在于机体组织中。它特异性催化GSH对过氧化氢的反应，起到保护细胞膜结构和功能完整的作用[29]。AG组GSH-Px活力显著高于BC组（P＜0.01），OLL、OLM组GSH-Px活力与BC组比较也有显著性差异（P＜0.05）。本研究中，OL剂量组的CAT、SOD和GSH-Px活力与BC组相比，均有导致生理效应趋好的效果。此结果与冬虫夏草相关报道一致，冬虫夏草具有抑制MDA生成，清除氧自由基、羟基自由基和超氧化物阴离子的作用[30]。抗氧化酶活力的提高能够缓解运动疲劳[31]。综合上述结果，可以认为OL具有较好的抗氧化作用，而口服抗氧化剂已经被证明能够降低氧化应激反应，缓解肌肉疲劳，提高运动能力[32]。因此，OL抗氧化作用可能是其具有抗疲劳功效的机理之一。

2.6 OL对小鼠血液参数的影响

血红蛋白作为疲劳恢复程度的重要指标，是红细胞的主要成分，主要功能是运输氧气和二氧化碳，保证机体氧气供应充足，进而促进机体有氧代谢，提高运动耐力。研究表明运动可以诱发血液单核细胞的变化，如淋巴细胞、单核细胞、白细胞[33]。

表5 OL对小鼠血液相关指标的影响（n＝10）Table5 Effect of OL on fatigue-related blood indices of mice (n= 10)

由表5可知，与BC组相比，OL各剂量组血红蛋白质量浓度和红细胞浓度均有所提高，OLL、AG组血红蛋白质量浓度极显著升高（P＜0.01）。AG组白细胞和淋巴细胞浓度极显著高于BC组（P＜0.01），OLM组白细胞和淋巴细胞浓度与BC组比较也显著升高（P＜0.05）。研究表明OL能维持或增加血红蛋白和红细胞浓度，保证机体氧气供应充足，提高有氧代谢能力，缓解疲劳。

3 结 论

OL能够通过增加机体肝糖原储备，减少BUN、BLA等代谢产物的产生和积累，提高机体SOD、GSH-Px、CAT活力，加强对自由基的清除，增加血液红细胞、血红蛋白含量来增加氧气和二氧化碳的运输效率，缓解运动疲劳。而且其功效与已有的具备明确改善机体抗疲劳药效的药物相似。本研究为充分利用OL，将OL开发为抗疲劳的运动营养剂提供了参考。