抑制紫色素杆菌12472群感效应放线菌的筛选

穆永其，曾 红，陈 伟,2

(1.塔里木大学 生命科学学院，新疆兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室，新疆阿拉尔 843300；2.塔里木大学 动物科学学院，新疆兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆阿拉尔 843300)

由于抗菌药物的滥用，细菌耐药问题日趋严重，使新抗生素的产生速度远低于细菌耐药性的产生速度。以直接杀死微生物或抑制其生长的传统靶点和筛选方法获得的抗生素，无法从根本上解决细菌耐药性的问题[1]。细菌耐药性是由群感效应控制的，其调控细菌色素产生、毒力基因表达、生物膜形成等[2]。因此，研发不抑菌抑制群感效应(Quorum sensing，QS)的新型药物，有望改良细菌耐药性问题，已成为当今生命科学研究的重点。

越来越多的研究表明，细菌耐药性与生物膜形成有关[3]。许多细菌由于具有形成生物膜的能力而对抗生素产生耐药性[4]。而QS则是控制生物膜形成的重要机制[5]。因此，寻找群感效应抑制剂(QS inhibitors，QSI)有望从新的角度解决细菌耐药性问题。本研究以源自新疆南疆地区的放线菌为材料，紫色素杆菌ATCC 12472为靶标菌，筛选群感效应抑制剂，为以QS为靶标的新型药物研发提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 菌株及培养基

1.1.1 菌株 紫色素杆菌ATCC 12472 由中国海洋大学馈赠。170 株新疆南疆地区放线菌均来自兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室。

1.1.2 培养基 高氏一号培养基：淀粉 20.0 g，KNO31.0 g，FeSO40.01 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，琼脂 16.0 g，pH 7.0～7.5，121 ℃灭菌 30 min。

Am6培养基：淀粉 20.0 g，葡萄糖 10.0 g，蛋白胨 5.0 g，酵母浸膏 5.0 g，CaCO35.0 g，琼脂 16.0 g，pH 7.0，115 ℃灭菌 30 min。

LB培养基：胰蛋白胨 10.0 g，酵母提取物 5.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂 16.0 g，pH 7.0～7.5，121 ℃灭菌 30 min。

1.2 放线菌菌株活化及发酵

将保藏的放线菌，菌液涂布于固体平板上，37 ℃恒温倒置培养 3～7 d 进行活化，观察菌落生长情况。在生长良好的固体平板菌上用蓝枪头打菌饼，接种于 500 mL、装液量为150 mL的种子培养基中(每瓶接 5～10 个菌饼)，30 ℃、180 r/min 培养 5～7 d。将生长良好的种子液按4%的接种量接种于 500 mL、装液量为 150 mL 的发酵培养基中，30 ℃、180 r/min 培养 7 d，同时观察菌体生长情况。发酵液 12 000 r/min 离心 15 min，取上清，0.45 μm 微孔滤膜无菌过滤，去除菌体后，-20 ℃贮藏，备用[6]。

1.3 放线菌发酵液对紫色素杆菌12472群感效应的影响

采用微量板半定量法[7]检测放线菌发酵液对ChromobacteriumviolaceumATCC 12472 群感效应抑制能力：按 1∶100 的接种比例将过夜培养的 12472 菌液 100 μL，接种至 10 mL LB培养基中，振荡摇匀。配制最终体积分数为50%的发酵液与菌液的混合液，吸取 200 μL 混合液至 96 孔细胞培养板中，每株接种 4 孔。每一培养板中同时设对照(等体积的 12472 菌液)与空白对照(等体积的 LB 培养基)各 4 孔。30 ℃ 恒温静置培养 24 h 后，取出 96 孔细胞培养板观察色素产生情况。用酶标仪测 OD590，检测紫色素杆菌的生长情况。所有试验均在不同时间重复 3 次。

1.4 紫色杆菌素定量方法

按Choo等[8]的方法测量紫色杆菌素：吸取1 mL培养好的菌液于1.5 mL离心管中，13 000 r/min 离心 10 min，使紫色杆菌素和菌体充分沉淀。去掉上清液，加 1 mL 二甲亚砜(DMSO)于离心管中，涡旋充分振荡，使紫色杆菌素溶解于DMSO 中。13 000 r/min 再次离心10 min，沉淀菌体及碎屑。测定上清 OD585nm处的光吸收值。

1.5 放线菌的分子生物学鉴定

参照文献[9]介绍的方法，PCR扩增放线菌的16S rDNA基因，送测序公司测序后比对。

2 结果与分析

2.1 抑制紫色素杆菌12472色素产生的放线菌筛选

从170株新疆南疆地区放线菌中筛选抑制紫色素杆菌12472色素产生的菌株。用微孔板半定量法初筛，选出抑制效果最好的有37株，占检测总菌株数的 21.74%；抑制效果适中的有22株，占检测总菌株数的 12.94%；抑制效果最差的有52株，占检测总菌株数的 30.59%；促进紫色经过多次发酵复筛，选出活性稳定、抑制紫色素杆菌12472色素产生效果最好的放线菌菌株5株(图2)，分别为TRM10325、10303′、20813、10311、11402。用紫色杆菌素定量方法，定量经发酵液处理后紫色素杆菌产色素能力的改变情况。其中放线菌TRM10325、10303′、20813、10311、11402的发酵液使紫色素杆菌12472产色素能力分别降低75.13%、65.46%、68.61%、84.72%和70.21%。

素杆菌生长的有45株，占检测总菌株数的 26.47%；抑制紫色素杆菌生长的有14株，占检测总菌株数的 8.24%(图1)。

图1 170 株放线菌抑制紫色素杆菌色素产生能力检测Fig.1 Performance of 170 actinomycetes strains on violacein production of C.violaceum ATCC12472

2.2 菌株鉴定

根据 16S rDNA 构建的系统发育树[10](图3)。测序结果在 NCBI 中比对[11]，显示5株菌TRM10325、10303′、20813、10311、11402均为链霉菌属。

图2 5株放线菌发酵液对紫色杆菌素产生的抑制Fig.2 Inhibition of violaceum production by five strains of actinomyces extract

图3 5株链霉菌TRM10325、10303′、20813、10311、11402 基于16S rDNA邻接法系统发育树Fig.3 The 16S rDNA Neighbor-joining phylogenetic tree of strain TRM10325,10303′,20813,10311,11402

3 讨 论

选取兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室从新疆南疆地区分离鉴定的放线菌，筛选抑制紫色素杆菌12472色素产生的活性菌株。经过反复验证，得到5株不抑菌、但抑制其紫色杆菌素产生的放线菌，分别为TRM10325、10303′、20813、10311、11402，经鉴定5株菌均为链霉菌属。

在试验初期发现紫色素杆菌12472不易存活，因此对其存活时间进行摸索。发现转接于固体培养基上的菌存活时间为16 d，在存活12 d以内活性最好。转接液体培养基中的菌存活时间约为13 d，在存活11 d以内活性最好。因此，从存活时间的长度来看，转接自固体培养基上的菌存活时间更久，所以在做活性验证试验时，会优先选择固体培养基上培养的紫色素杆菌。而关于紫色素杆菌12472存活时间的试验，尚未见文献报道。

从试验中发现，不抑制菌生长、但抑制其紫色杆菌素的产生，主要有3种情况：①菌体正常生长，但几乎是无色的，只有微量的紫色杆菌素产生。②菌体正常生长，紫色杆菌素恢复的很快，24 h 后就恢复正常的紫色。③菌体正常生长，紫色杆菌素恢复较慢，24 h后只有薄薄的紫色。过几天后，紫色又会恢复正常。为了排除抑菌导致紫色杆菌素减少的情况，做如下处理：首先用酶标仪测OD590，与紫色素杆菌的对照组进行比较，看菌体生长量是否下降，下降证明抑菌；其次用观察法验证，抑菌的孔一般是透亮的，而有菌体生长的孔呈浑浊。

本试验所用的微孔板半定量法是筛选 QSI 的有效方法，其中用96孔板法筛选紫色素杆菌QSI，目前尚未见报道。用微孔板半定量法对放线菌发酵液进行群感效应抑制活性的筛选，得到37株不抑菌，但抑制紫色素杆菌12472色素产生的放线菌菌株，其中TRM10325、10303′、20813、10311、11402等5株菌，经过反复验证，抑制活性较好。在后续的试验中，将对活性放线菌进行大批量发酵，分离纯化单体活性化合物，探究其抑制机制，希望能为细菌感染提供新的治疗策略，并为研发新药提供试验依据。