清胰汤和姜黄素调整肠道微生态对重症急性胰腺炎的治疗机制

2018-11-29胡炜刘洪斌王曼雪张桂贤李东华张一

天津医药 2018年11期

胡炜，刘洪斌，王曼雪，张桂贤，李东华，张一

重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）的高患病率、高病死率已严重干扰着患者的生存质量，病死率可达20%～30%［1］。所以SAP的临床转归备受医学界关注。研究表明，肠道菌群可被认为人体内的第二大基因组，其与肠道黏膜的屏障关系密切，可以抑制病原微生物的“定植”［2］。传统方法对肠道菌群进行定向培养只能检测到部分的菌群。近来，人们比较倾向于采用16S rDNA基因组测序技术来探索肠道菌群的分布，其可以比较全面地检测到菌群的种类、丰度以及分布特征，可信度高［3］。Li等［4］研究发现，SAP病情发展可能与肠道微生态的平衡有关。清胰汤有抑菌、抗炎、利胆和促进肠蠕动的作用，被证明是治疗SAP的有效方剂［5］。姜黄素具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等多重功效，尤其在炎症性疾病的治疗中有重要地位［6］。本文通过观察在清胰汤或姜黄素的治疗下，SAP大鼠的肠道黏膜和胰腺组织的病理变化以及通过收集各组大鼠盲肠段的粪便进行16S rDNA测序，定量分析肠腔内菌群数量的改变，评价中药方剂清胰汤以及姜黄素在SAP大鼠肠道菌群变化中的作用。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 RM2235/2245切片机、ASP300脱水机、DM4000B显微镜、M4000B图像采集仪（德国Leica公司）；Qubit®2.0 Fluorometer荧光计和Qubit™ dsDNA HS核酸定量分析试剂盒（Invitrogen公司）；96孔磁力架和9700型PCR扩增仪（Life Technologies公司）；微型离心机和电热恒温水槽（Eppendorf公司）。清胰汤（柴胡15 g、黄芩10 g、胡连10 g、杭芍15 g、木香10 g、元胡10 g、大黄15 g、芒硝10 g，南开医院药房）；姜黄素（Sigma公司）；高保真DNA聚合酶（KAPA公司，货号2612）；高敏感度DNA检测试剂盒（Agilent公司，批号5067-4626）；纯化磁珠Agencourt®AMPure XP Beads核酸纯化试剂盒（Beckman公司，货号A63881）；Agilent 2100生物分析仪、SY-410-1003型MiSeq测序仪、MiSeq测序试剂盒v3（货号MS-102-3003）、MiSeq测序试剂盒v2（货号MS-102-2003）（Illumina公司）。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组 SPF级健康Wistar大鼠，雄性，40只，体质量（300±10）g，购自军事医学科学院卫生学环境医学研究所动物实验中心，许可证号SCXK-（军）2014-0001。将动物常规喂食1周后，按照随机数字法分为4组，对照组、模型组、清胰汤组、姜黄素组，每组10只。

1.2.2 动物模型的制备清胰汤组和姜黄素组分别按体质量予10 mL/kg和60 mg/kg中药汤剂灌胃预处理，每日1次，连续7 d。其他组给予等量的0.9%的NaCl溶液。按照文献［7］的方法，动物实验前禁食12 h，不禁水。术前10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，开腹后将模型组、清胰汤组和姜黄素组动物的胆胰管内逆行注射5%牛黄胆酸钠（Na-Fc）1 mL/kg，速率0.05 mL/min，观察5～10 min后关腹。对照组仅在开腹后轻轻翻动胰腺几次，即关闭腹腔，然后放回鼠笼，常规喂养，密切关注其生命体征。

1.2.3 样本的采集 24 h后，采用颈椎脱臼法处死大鼠，收集各组样本的胰腺、肠组织以及盲肠段粪便5～10 g，将组织放入10%福尔马林溶液中固定，粪便则置于冻存管后，立即放入-80℃保存，待检测。

1.2.4 苏木素-伊红（HE）法染色观察各组胰腺和肠道的病理变化各组胰腺、肠组织固定24 h后，脱水、浸蜡、包埋，4µm切片后，脱蜡，苏木精染色8 min，1%盐酸乙醇分色，蒸馏水冲洗10 min，0.5%伊红染色，脱水，中性树胶封存。各组组织在Leica LAS Extended Annotation模块的软件显微镜下观察，其中组织病理评分以chiu’s肠组织损伤评分标准［8］和schmidtt胰腺组织评分标准［9］作为参考。

1.2.5 粪便菌群DNA的抽提与质检以及16S rDNA基因组的测序参照粪便基因DNA提取试剂盒说明书，抽提所得DNA采用Qubit 2.0和0.8%琼脂糖凝胶电泳进行质检。将质检合格的基因组DNA纯化后进行两轮PCR扩增，构建样本测序文库，Qubit®2.0荧光剂检测样本浓度，Agilent 2100检测文库的大小，然后按照MiSeq测序试剂说明书，进行上机测序，鉴定肠道菌群组成以及表达峰度。Chao指数与ACE指数为测量菌群的微生物种类即丰富度指标，其值越大，物种越丰富；Shannon指数和Simpson指数为物种多样性指标，Shannon指数越大，Simpson指数越小，代表物种越丰富。

1.3 统计学方法由Illumina提供的数据收集软件（data collection software）进行数据收集和实时分析。采用Graphpad prism 5.0软件进行统计学处理，符合正态分布的计量资料均以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t检验。非正态分布的数据分析采用秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组肠、胰腺组织中HE染色观察以及病理评分结果与对照组相比，模型组出现肠壁水肿，肠黏膜绒毛变短、缺损、坏死、上皮与固有层分离甚至剥脱，上皮下间质之间的腔隙增宽，毛细血管塌陷，中性粒细胞明显浸润等病理表现，清胰汤、姜黄素组与模型组相比，镜下可见肠黏膜受损程度均较轻，有部分的肠绒毛缺损以及微血管破裂、出血量也较模型组少，可以基本维持肠组织的完整性。模型组中胰腺组织可见腺泡细胞明显肿胀、坏死，小叶结构紊乱，叶间隙明显增宽，间质内有大量炎性细胞浸润、毛细血管破裂等病理表现，见图1。清胰汤、姜黄素组与模型组相比，病理评分明显降低（P＜0.05），见表1。

2.2 粪便中肠道菌群分析

Fig.1 HE staining of the intestinal and pancreatic tissues（×200）图1 各组肠、胰腺组织的苏木素-伊红（HE）染色情况（×200）

Tab.1 The pathologic scores of intestinal and pancreatic tissues表1 各组肠、胰腺组织的病理评分情况（分，n=10，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与模型组比较，P＜0.05；表2～5同

组别对照组模型组清胰汤组姜黄素组F肠组织1.32±0.24 4.17±0.28a 3.00±0.33ab 2.78±0.19ab 58.46＊＊胰腺组织0.98±0.17 3.49±0.31a 2.34±0.28ab 2.52±0.29ab 44.58＊＊

2.2.1 可操作单元（OTU）层面对照组、模型组、清胰汤组、姜黄素组分别有6、8、9、6份样本。共29份样本的16S rDNA的V3区进行上机测序，所有样本Tags进行预聚类后，在0.03距离即97%的相似度下，得到的OTU值如图2所示。对照组、模型组、清胰汤组和姜黄素组OTU层面分别为（1 723±39）、（1 978±54）、（2 012±73）和（1 958±105）个，差异有统计学意义（F=5.616，P＜0.05）。测序的29个样本曲线最终基本均趋于平坦，说明测序的样本量足够大，具有一定程度的代表性，基本可以反映出测序的绝大多数菌群物种的生物信息，见图3。

2.2.2 肠道菌群Alpha多样性分析 ACE、Chao、Shannon指数均为清胰汤组＞模型组＞对照组；姜黄素组＞模型组＞对照组，Simpson指数清胰汤组＜模型组＜对照组；姜黄素组＜模型组＜对照组（均P＜0.05），见表2。

2.2.3 肠道菌群结构分析其中的主要优势菌属（＞1%）。（1）门水平分析：p__Saccharibacteria、p__Proteobacteria（变形菌门）和p__Tenericutes（柔膜菌门）数量，清胰汤组或姜黄素组与模型组、对照组比较差异无统计学意义（均P＞0.05）。p__Firmicutes（厚壁菌门）数量，模型组＞清胰汤组＞对照组；模型组＞姜黄素组＞对照组。p__Bacteroidetes（拟杆菌门）数量，对照组＞清胰汤组＞模型组；对照组＞姜黄素组＞模型组，差异有统计学意义（均P＜0.05），见表 3。（2）纲水平分析：c__Deltaproteobacteria（δ变形菌纲）、c__Epsilonproteobacteria（ε-变形菌）数量，清胰汤组或姜黄素组与模型组、对照组之间比较差异无统计学意义（均P＞0.05）。c__Bacilli（芽孢杆菌纲）数量，模型组＞清胰汤组＞对照组，模型组＞姜黄素组＞对照组；c__Clostridia（梭菌纲）数量，模型组＞姜黄素组＞对照组；c__Bacteroidia（拟杆菌纲）数量，对照组＞姜黄素组＞模型组，差异具有统计学意义（均P＜0.05），但 c__Clostridia（梭菌纲）、c__Bacteroidia（拟杆菌纲）数量，清胰汤组与模型组之间比较差异无统计学意义（均P＞0.05），见表4。（3）属水平分析：g__Desulfovibrio（脱磷孤菌属）、g__Lactobacillus（乳酸杆菌属）、g__Ruminiclostridium_9（梭状芽孢杆菌属）、g__Helicobacter（螺杆菌属）、g__Ruminococcaceae_UCG-014（疣微菌属）、g__Escherichia-Shigella（大肠埃希菌属）、g__Oscillibacter（颤杆菌克属）、g__Eubacterium（优杆菌属）数量，清胰汤组或姜黄素组与模型组、对照组之间比较差异无统计学意义（均P＞0.05）。g__Lachnos piraceae_NK4A136（毛螺菌属NK4A136）和g__Bacteroides（拟杆菌属）数量，清胰汤与模型组、姜黄素组与模型组以及模型与正常组之间差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表5。

Fig.2 The number of OTUs for all samples图2 所有样本的OTUs数目

Fig.3 Shannon-Wiener curves图3 香农-威纳指数曲线

Tab.2 Comparison of Alpha diversity index between four groups表2 各组Alpha多样性指数比较（±s）

组别对照组模型组清胰汤组姜黄素组F n6 8 9 6 ACE 4 973±547 6 147±681a 7 691±1 100ab 7 517±1 184ab 4.041＊Chao 3 322±268 4 079±353a 5 540±641ab 5 112±554ab 4.253＊Shannon 4.41±0.14 5.13±0.15a 5.35±0.14ab 5.29±0.36ab 13.92＊＊Simpson 0.017±0.004 0.028±0.005a 0.013±0.004ab 0.014±0.005ab 3.069＊

3 讨论

重症急性胰腺炎发病迅速，病情严重，并发症多，死亡率高，已成为医学重大难题。人体内肠道细菌有1 000种以上，肠道菌群在机体营养吸收、抵抗外来病原体的入侵以及维持体内微生物环境方面起着重要的作用。有研究表明，肠道菌群不仅与消化系统、免疫系统疾病有关，与心血管疾病、癌症、糖尿病、肥胖等也有一定的关系，因其物种的丰富性以及功能的多样性，有人称之为人体的另一个“器官”［10-11］。

厚壁菌门在纲水平可分为梭菌纲、芽孢杆菌纲以及柔膜菌纲，可产生芽孢，有些芽孢具有强致病性，如炭疽芽孢杆菌和肉毒梭菌等，也有些芽孢为有益的梭菌如普拉梭菌。有报道称，普拉梭菌活菌可以调控TNF-α、IL-12、IL-10等细胞因子的分泌以抗炎，另外其产物丁酸还可以为肠黏膜通过非消化道提供能量等［12-13］。优势菌属拟杆菌门约占人和动物消化道肠道菌群的25%。脆弱拟杆菌具有促进免疫系统发育成熟的功效，在缺乏免疫系统的裸鼠上，注入脆弱拟杆菌后，可通过调控小鼠的T淋巴细胞,使其具有调节炎症反应的能力［14］。毛螺菌属于毛螺菌科的主要菌属，其可触发肠道炎症（即结肠炎）的发生，加剧结肠炎病情［15］。乳酸杆菌属于大家熟知的益生菌群。清胰汤在临床上SAP的治疗作用已基本得到大家的认可［16］。另外有研究表明，清胰汤可通过减少SAP大鼠肠道的菌群移位，有效抑制胃肠道对内毒素的吸收作用，从而降低血清中内毒素的含量，保护肠屏障［17］；姜黄素具有抑制SAP大鼠中STAT3 途径［18］、抑制趋化因子 ENA-78［19］、降低 IL-33、TNF-α、IL-1β和AMY等细胞因子的分泌等［20］广泛的药理作用，减轻炎症反应，最终达到对SAP胰腺及其并发的脏器如肝、肾、肠等损伤的保护作用，已广泛应用于SAP基础研究中。

Tab.3 Comparison of the dominant microflora of the phylum between four groups表3 门水平优势菌群属比较（±s）

组别对照组模型组清胰汤组姜黄素组F n6 8 9 6 p__Firmicutes 0.324±0.054 0.547±0.064a 0.431±0.054ab 0.439±0.200ab 7.785＊＊p__Bacteroidetes 0.541±0.075 0.359±0.056a 0.399±0.055ab 0.461±0.184ab 5.832＊＊p__Saccharibacteria 0.001±0.051 0.011±0.049 0.018±0.041 0.019±0.031 2.468 p__Proteobacteria 0.056±0.002 0.071±0.003 0.069±0.010 0.067±0.013 0.186 p__Tenericutes 0.029±0.027 0.006±0.001 0.006±0.001 0.005±0.003 1.522

Tab.4 Comparison of the dominant microflora of the class between four groups表4 纲水平优势菌群属比较（±s）

组别对照组模型组清胰汤组姜黄素组F n6 8 9 6 c__Clostridia 0.311±0.052 0.519±0.057a 0.518±0.064b 0.405±0.197ab 6.548＊＊c__Bacteroidia 0.535±0.077 0.359±0.057a 0.349±0.055b 0.462±0.184ab 5.492＊＊c__Deltaproteobacteria 0.015±0.023 0.028±0.010 0.030±0.010 0.033±0.012 1.956 c__Bacilli 0.008±0.006 0.040±0.026a 0.025±0.027ab 0.025±0.011ab 5.905＊＊c__Epsilonproteobacteria 0.030±0.031 0.018±0.014 0.009±0.007 0.017±0.018 1.506

Tab.5 Comparison of the dominant microflora of the genus between four groups表5 属水平优势菌群属比较（±s）

组别对照组模型组清胰汤组姜黄素组F n6 8 9 6 g__Lachnospiraceae_NK4A136 0.116±0.029 0.158±0.023a 0.054±0.054b 0.123±0.065ab 6.219＊＊g__Bacteroides 0.089±0.037 0.013±0.003a 0.025±0.014b 0.027±0.012ab 21.080＊＊g__Desulfovibrio 0.033±0.022 0.029±0.010 0.014±0.011 0.027±0.012 2.006 g__Lactobacillus 0.039±0.006 0.008±0.026 0.025±0.027 0.025±0.011 2.411 g__Ruminiclostridium_9 0.025±0.003 0.019±0.006 0.011±0.007 0.025±0.025 1.724组别对照组模型组清胰汤组姜黄素组F n6 8 9 6 g__Helicobacter 0.017±0.032 0.009±0.014 0.030±0.007 0.018±0.018 1.506 g__Ruminococcaceae_UCG-014 0.012±0.002 0.019±0.006 0.014±0.009 0.021±0.007 2.288 g__Escherichia-Shigella 0.014±0.002 0.018±0.041 0.004±0.033 0.023±0.018 0.482 g__Oscillibacter 0.013±0.006 0.014±0.009 0.010±0.009 0.023±0.008 2.843 g__Eubacterium 0.014±0.004 0.019±0.004 0.006±0.012 0.012±0.011 2.141

大鼠发生SAP时，正常肠道黏膜屏障破坏、肠道菌群失调，为肠道细菌和内毒素的移位提供了通道，内毒素进入血液循环，刺激吞噬细胞释放大量的炎症细胞因子和介质，可诱发脓毒血症和多脏器功能衰竭的发生［21］。本实验中，从对大鼠胰腺、结肠组织的HE染色、病理评分可知，SAP大鼠的肠道黏膜屏障发生严重的破坏，出现明显的肠道菌群失调现象，若实验前给予大鼠中药清胰汤和姜黄素预处理1周后，可使大鼠肠黏膜和胰腺病理受损程度较SAP模型组减轻，说明用牛黄胆酸钠造模SAP大鼠成功。通过粪便的16S rDNA测序可知，清胰汤或（和）姜黄素组可有效降低SAP大鼠厚壁菌门（包括梭菌纲、芽孢杆菌纲）、毛螺菌属数量菌群含量，升高拟杆菌门（包括拟杆菌纲、拟杆菌属）和乳酸杆菌属含量。综上所述，从功效方面，中药清胰汤和姜黄素具有改善重症急性胰腺炎胰腺组织损伤的功效，对保护肠黏膜屏障有一定的作用。从微生态方面，中药清胰汤和姜黄素可增加SAP大鼠的肠道菌群的多样性和丰富性，调控微生物生态平衡，增加益生菌群的含量，降低有害菌群的定植能力，从而达到对肠道的保护作用。但微生物菌群的纲、门、科、属、种分类后，种类较多，本实验仅从优势菌属中探讨各实验组中微生态变化，还不够全面，仍需要进一步更全面的、更深入的研究其他的变化。