慢病毒介导的microRNA-155过表达对肝癌细胞HepG2增殖的影响

牛连杰，张雅敏，武兆国

肝细胞癌（HCC）是第六大致命恶性肿瘤，在全球癌症相关死亡中位居死亡率第三位［1］。microRNAs（miRNAs）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的短链非编码RNA，可通过降解mRNA或抑制mRNA翻译，调控众多基因的表达，在胚胎的发生、组织器官发育、细胞生长分化与凋亡、疾病发生和发展等生命活动中起重要作用［2］。miRNAs与肝癌密切相关，特定miRNA在肝癌发生、发展中的作用正成为肝癌研究的新热点，miRNAs有望成为肝癌治疗的新靶点［3］。本研究通过在HepG2细胞中过表达miR-155，检测miR-155对肝癌细胞系HepG2增殖的影响。

1 资料与方法

1.1 主要试剂及仪器 人肝癌细胞系HepG2由南开大学器官移植重点实验室保存；胎牛血清、低糖培养基（Gibco公司）；Trizol及Lipo2000试剂（Invitrogen公司），带荧光标记和嘌呤霉素筛选的miR-155 hRNA质粒及阴性对照质粒（复能基因，广州）；引物合成由天津华大生物公司完成；反转录试剂盒及实时定量PCR用SYBR Green染料（全式金生物公司，北京），PTEN抗体（万类生物，沈阳），CyclinD1和CyclinA1+A2（Abcam公司，美国），CCK-8试剂（博士得生物公司，武汉）。Real-time PCR仪：LightCycler®480（罗氏公司，瑞士），荧光显微镜（奥林巴斯公司，日本），CO2培养箱（赛默飞公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 质粒的提取和病毒包装 质粒的提取：成熟质粒转化50µL的DH5α感受态细胞，菌液摇床过夜（12～16 h），按照无内毒素质粒提取试剂盒说明书（康为世纪，北京）提取质粒。慢病毒的包装及病毒滴度测定按照文献［4］方法进行。

1.2.2 HepG2的分组及转染 试验分为3组：空白对照组（N组）即未做任何处理；干扰组（过表达miRNA-155，H组），即上调HepG2细胞中的miR-155；阴性对照组（negative control，NC组），即转染空病毒。将对数生长期的HepG2细胞按照上述分组转染，24 h后换液，48 h后换新鲜培养基，加1 g/L的嘌呤霉素，每24 h更换新鲜培养基，直至未做任何处理的细胞全部死亡，荧光显微镜观察转染效率。

1.2.3 qRT-PCR检测转染后HepG2细胞miR-155和PTEN mRNA表达 分组及操作如1.2.2所述，两个6孔板同时操作。慢病毒转染72 h后收集细胞，采用qRT-PCR检测miR-155及PTEN的表达水平，判断转染效果。miR-155和PTEN引物序列见表1。以各自的下游引物作为逆转录特异性引物，均由天津华大生物公司合成。按说明书配制PCR体系。反应条件：95℃预变性10 min；95℃变性10 s，60℃退火、延伸60 s，共40个循环。每个样本均检测4次，采用2-ΔΔCt方法计算miRNA-155和PTEN相对表达量。

1.2.4 Western blot检测细胞周期相关蛋白的表达 提取细胞总蛋白，10%SDS-PAG电泳，320 mA、90 min冰浴转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗于4℃冰箱过夜，二抗室温孵育1 h，显影曝光观察相对表达情况。

Tab.1 Sequence of each gene primer表1 各基因引物序列

1.2.5 CCK-8法检测细胞增殖情况 收集各组细胞，待细胞生长状态良好，以每孔2×107/L的密度接种于96孔板，培养0、12、24、48和72 h后分别进行CCK-8检测。加入10 µL CCK-8试剂，继续在37℃、5%CO2条件下培养2 h，检测波长在450 nm处吸光度（OD）值，每组设4个复孔。

1.3 统计学方法 采用SPSS 24.0统计学软件。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较应用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病毒滴度测定 miR-155-hRNA-LV和NEGGFP-LV均为2×109TU/mL。

2.2 转染效率及miR-155、靶基因PTEN相对表达量 荧光显微镜下观察转染效率，H组和NC组两者均大于90%，见图1。H组miR-155表达量明显高于NC组及N组，靶基因PTEN的表达量低于NC组及N组（均P＜0.05），见表1。

Fig.1 Results of fluorescence microscopy of virus infected HepG2 cells（×100）图1 荧光显微镜观察病毒感染HepG2细胞转染效率（×100）

2.3 Western blot检测结果 H组PTEN的表达量明显低于NC组和N组，而CyclinD1、CyclingA1+A2的表达量明显高于NC组和N组（均P＜0.05），见图2、表3。

Tab.2 Relative expression levels of microRNA-155 and PTEN after transfection表2 转染后各组microRNA-155和PTEN相对表达量（n=4，±s）

Tab.2 Relative expression levels of microRNA-155 and PTEN after transfection表2 转染后各组microRNA-155和PTEN相对表达量（n=4，±s）

＊＊P＜0.01：a与N组比较，b与NC组比较，均P＜0.05

组别N组NC组H组F miR-155 1.030±0.065 1.011±0.022 1.583±0.035ab 161.400＊＊PTEN 0.993±0.011 0.986±0.023 0.653±0.029ab 226.600＊＊

Fig.2 Results of PTEN,CyclinD1,and CyclingA1+A2 detected by Western blot assay in three groups图2 各组Western blot检测PTEN、CyclinD1、CyclingA1+A2结果

Tab.3 Relative gray scale of Western blot assay in three groups表3 各组蛋白Western blot相对灰度值 （n=3，±s）

Tab.3 Relative gray scale of Western blot assay in three groups表3 各组蛋白Western blot相对灰度值 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01：a与N组比较，b与NC组比较，均P＜0.05

组别N组NC组H组F PTEN 0.878±0.022 0.889±0.017 0.356±0.022ab 687.237＊＊CyclinD1 0.399±0.008 0.389±0.019 0.660±0.040ab 107.527＊＊CyclinA1+A2 1.092±0.027 1.065±0.025 1.643±0.063ab 177.817＊＊

2.4 各组CCK-8增殖实验测定结果 3组12 h时OD值开始出现差异，24、48、72 h时H组OD值均大于NC组和N组（P＜0.05），见表4。

3 讨论

miRNAs与肝癌密切相关，研究特定miRNAs在肝癌发生、发展中的作用正成为肝癌研究新热点［5］。miR-155作为miRNAs家族一员，是一种多功能microRNA。大量研究证实，miR-155在免疫应答、自身免疫性疾病和心血管系统疾病等免疫炎症性疾病，以及各种肿瘤（胶质母细胞瘤、白血病、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌和肝癌）中发挥重要作用［6］。miR-155可在翻译水平靶向调控MyD88的表达，从而抑制免疫炎症反应［7］。目前，miR-155可通过阻止上皮间质转化（EMT）过程和ERK1信号通路，从而减弱肝星状细胞的活化［8］。另有研究显示，miR-155通过靶向ARID2介导的Akt磷酸化通路促进肝癌肿瘤生长，并可能作为一种新的肝癌预后生物标志物和治疗靶点［9］。因此，miR-155在疾病发生、发展过程中的作用以及具体机制可能具有多样性。

目前，有关建立稳定过表达的miR-155的肝癌细胞系的相关研究较少。本研究利用慢病毒载体构建稳定过表达miR-155的HepG2细胞，从不同水平检测细胞增殖水平的变化。本实验成功地构建了miR-155慢病毒表达载体。qRT-PCR结果表明，miR-155可抑制PTEN基因的表达而促进了细胞增殖；Western blot结果表明H组PTEN的表达量明显低于NC组和N组，而CyclinD1、CyclinA1+A2的表达量明显高于NC组和N组，CCK-8检测结果表明12 h时3组OD值开始出现差异，24 h后H组OD值均大于NC组和N组，表明从基因水平、蛋白水平和细胞水平变化均证实了miR-155具有显著促进肝癌细胞增殖的作用。因此，笔者认为miRNA-155在调控肝癌细胞增殖中发挥重要作用，miR-155表达上调使PTEN基因的表达下调，但CyclinD1、CyclinA1+A2的表达增加说明miR-155对细胞生物学水平的调控不止一种信号通路，但具体的作用机制和信号通路有待进一步研究。

综上所述，miR-155与肝癌发生、发展密切相关，miR-155具有癌基因样功能，可能是肝癌相关miRNA编码基因。miR-155也许能够成为患者早期诊断、治疗方案选择的分子标志物。这为临床研究miR-155信号通路抑制剂提供了理论和实验依据。

Tab.4 Comparison of relative OD by CCK-8 assay between three groups表4 各组CCK-8检测OD值比较 （n=3，OD值，±s）

Tab.4 Comparison of relative OD by CCK-8 assay between three groups表4 各组CCK-8检测OD值比较 （n=3，OD值，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01：a与N组比较，b与NC组比较，均P＜0.05

组别N组NC组H组F 72 h 0.985±0.022 0.958±0.022 1.577±0.028ab 598.500＊＊0 h 0.230±0.007 0.230±0.011 0.235±0.006 0.342 12 h 0.264±0.009 0.270±0.009 0.302±0.011ab 13.080＊＊24 h 0.375±0.006 0.368±0.007 0.592±0.008ab 929.300＊＊48 h 0.720±0.012 0.730±0.011 1.164±0.057ab 165.900＊＊