姜黄素对非小细胞肺癌A549细胞增殖凋亡和侵袭能力的影响

陈永宏，高 月

（重庆市北碚区中医院，重庆 400700）

非小细胞肺癌是我国发病率和致死率最高的肿瘤性疾病，高度的侵袭性是其致死率高、复发率高的主要原因。目前，抗肿瘤药物的作用机制大多数都是以提高肿瘤细胞凋亡率，降低肿瘤细胞增殖能力和侵袭能力为主。有研究提出，某些药物对肿瘤细胞的上述一个特性或多个特性存在着影响作用。姜黄素是从姜黄根茎中提取出来的酚类化合物，具有抗炎、抗氧化和抑制肿瘤细胞生长的能力[1]。本研究中探讨了姜黄素对肿瘤细胞的增殖、凋亡和侵袭功能的影响机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与细胞

仪器：722n型分光光度计（上海菁华科学仪器有限公司）；acea novocyte型流式细胞分析仪（艾森生物有限公司）；奥林巴斯cx23型光学显微镜（奥林巴斯株式会社）；genosens1850型凝胶成像仪（上海勤翔凝胶科学仪器有限公司）。

试药：姜黄素（上海士锋生物科技有限公司，批号B10359-25g）；二甲基亚砜（上海士锋生物科技有限公司，批号 A5852）；小牛血清（批号 HLC1401），1640 培养基（批号HLC150120）均购于上海哈林生物科技有限公司。四甲基偶氮唑盐溶液(批号M2003）；DMSO溶液(批号 D2650）；胰酶(批号 T4674）；binding buffer，Annexin-FITC，Propidum Iodide细胞凋亡检测试剂盒(批号APOAC-1KT）均购于Sigma公司。P27单克隆抗体 (批号 P2092），Orai1 单克隆抗体(批号 O8264），Caspase-3单克隆抗体 (批号c8487），EGFR单克隆抗体(批号SAB4300352），STIM1 单克隆抗体(批号 S6197），E-cadherin单克隆抗体(批号U3254），MMP-9单克隆抗体(批号 SAB4501896），GAPDH单克隆抗体(批号G9295）均购于Sigma公司。

细胞：非小细胞肺癌A549细胞由西南医院呼吸内科赠送。

1.2 方法

细胞培养方法：将对数期非小细胞肺癌A549细胞用含有7%小牛血清的1640培养基，按1∶5的比例在37 ℃、5%CO2条件下培养[2]。

姜黄素溶液配置方法：将5．90 mg姜黄素用200 μL二甲基亚砜溶解，再加入7 800 μL无血清1640培养基配制成质量浓度为2 000 μmol/L的姜黄素溶液原液[3]。

MTT法检测细胞增殖情况：将细胞浓度调整为50 000个/mL后，按150mL/孔加入96孔板，在37℃及5%CO2环境下培养24 h，吸出上清液，分别于低、中、高剂量组细胞培养孔中分别加入姜黄素溶液(姜黄素质量浓度分别为 10，20，40 μmol/L）和培养基，调整各孔体积为150 μL，对照组则只加入等体积的培养基。在上述环境中继续培养48 h，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，再培养4 h，吸出各孔上清液，加入DMSO溶液150 μL，震荡10 min，在酶标仪上检测各孔在490 nm波长处的吸光度。细胞生长抑制率=（对照组吸光值-实验组吸光值）/对照组吸光值[4-5]。

流式细胞分析技术检测细胞凋亡情况：将各组细胞浓度为4×105个/mL的细胞分别在不含姜黄素的培养基和姜黄素质量浓度为10，20，40 μmol/L的培养基中培养48 h后，收集细胞，尔后用胰酶消化，洗涤，然后用binding buffer细胞凋亡检测试剂盒重悬，加入Annexin-FITC和Propidum Iodide细胞凋亡检测试剂盒孵育0．5 h，最后使用流式细胞分析仪检测样本[6]。

Transwell侵袭转移实验检测细胞侵袭能力：将对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组细胞分别用不含姜黄素的培养基和含姜黄素质量浓度为10，20，40 μmol/L的培养基培养48 h后，离心重悬，调整细胞浓度为4×105个/mL，将用50 mg/L的 matrigel 1∶8稀释液湿润后的transwell小室风干，然后每个小室加入200 μL F-12培养基，分别加入培养后的细胞，调整细胞浓度为4×105个/mL，将小室放在24孔板上（每孔内含F-12培养基 200 μL），在 37 ℃、5%CO2环境下培养 24 h。将 24 孔板内加入4%多聚甲醛1 mL，再放入小室，固定20 min，然后风干，染色，在显微镜下观察，计数细胞数量。侵袭抑制率 =（1-各实验组细胞数 /对照组细胞数）×100%[7]。

Western Blotting法检测增殖凋亡相关蛋白和侵袭相关蛋白的表达情况：将对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组细胞分别用不含姜黄素的培养基、含姜黄素浓度为 10，20，40 μmol/L 的培养基，调整细胞浓度为4×105个 /mL，放入 12孔板中，在 37℃、5%CO2环境下培养48 h。提取细胞总蛋白，使用BCA法检测细胞总蛋白，最后制胶，电泳，转膜，封闭，然后分别用P27，Orai1，Caspase-3，EGFR，STIM1，E-cadherin，MMP-9，GAPDH兔抗人单克隆蛋白在37℃条件下对上述样品进行封闭，最后按说明书加入二抗结合，洗涤，成像[8]。

1.3 统计学处理

采用SPSS 22．0统计学软件分析。计量资料以均数±标准差(±s）表示，用t检验。P<0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞增殖凋亡情况

由表1可知，对照组细胞吸光度显著高于低剂量组，低剂量组显著高于中剂量组，中剂量组显著高于高剂量组（P<0．05）；而增殖抑制系数和凋亡率对照组显著低于低剂量组，低剂量组显著低于中剂量组，中剂量组显著低于高剂量组（P<0．05）。说明姜黄素对非小细胞肺癌A549细胞增殖能力有抑制作用，同时还有诱导细胞凋亡的作用，且与姜黄素存在剂量依赖关系。

表1 各组细胞增殖凋亡能力检测结果（±s）

表1 各组细胞增殖凋亡能力检测结果（±s）

注：与对照组相比，aP<0．05；与低剂量组相比，bP<0．05；与中剂量组相比，cP<0．05。下表同。

组别对照组低剂量组中剂量组高剂量组吸光度0．853 ±0．021 0．752 ±0．015a 0．674 ±0．014ab 0．537 ±0．011abc增殖抑制系数（%）0 11．84 ±0．98a 20．98 ±1．24ab 37．05 ±2．23abc凋亡率（%）4．17 ± 0．87 9．83 ± 0．92a 15．76 ± 1．01ab 25．87 ± 1．22abc

2.2 细胞增殖凋亡相关蛋白表达情况

由表2可知，P27和Caspase-3蛋白的表达量，对照组显著低于低剂量组，低剂量组显著低于中剂量组，中剂量组显著低于高剂量组（P<0．05）。EGFR，Orai1，STIM1蛋白表达，对照组显著高于低剂量组，低剂量组显著高于中剂量组，中剂量组显著高于高剂量组（P<0．05）。说明姜黄素可有效影响细胞增殖凋亡相关蛋白的表达，且存在剂量依赖关系。

表2 各组细胞增殖和凋亡能力相关蛋白表达情况( ± s）

表2 各组细胞增殖和凋亡能力相关蛋白表达情况( ± s）

组别对照组低剂量组中剂量组高剂量组P27/GAPDH 1．01±0．05 1．83±0．07a 3．72±0．10ab 5．56±0．11abcOrai1/GAPDH 1．04±0．02 0．92±0．03a 0．76±0．04ab 0．53±0．02abc Caspase-3/GAPDH 67．2±7．5 110．6±9．3a 154．9±10．4ab 193．7±11．2abc EGFR/GAPDH 5．79±0．10 3．75±0．93a 2．51±0．89ab 1．42±0．78abc ST1M1/GAPDH 1．02±0．09 0．84±0．05a 0．68±0．03ab 0．48±0．02abc

2.3 细胞侵袭能力及侵袭相关蛋白表达情况

由表3可知，视野细胞数和MMP-9蛋白的表达量对照组显著高于低剂量组，低剂量组显著高于中剂量组，中剂量组显著高于高剂量组（P<0．05）；侵袭抑制率和E-cadherin表达量，对照组显著低于低剂量组，低剂量组显著低于中剂量组，中剂量组显著低于高剂量组（P<0．05）。说明姜黄素有抑制A549细胞侵袭的作用，且存在剂量依赖关系。

表3 各组细胞侵袭能力及侵袭相关蛋白表达量检测结果(±s）

组别对照组低剂量组中剂量组高剂量组视野细胞数124．56 ±3．67 83．24 ±3．23a 67．48 ±3．01ab 40．76 ±2．01abc侵袭抑制率（%）0 33．17 ±2．43a 45．83 ±3．43ab 67．28 ±4．24abc E-cadherin/GAPDH 0．612 ± 0．026 0．723 ± 0．023a 0．806 ± 0．017ab 0．902 ± 0．018abc MMP-9/GAPDH 0．792 ±0．019 0．685 ±0．018a 0．579 ±0．013ab 0．421 ±0．011abc

3 讨论

P27和EGFR是2个与细胞周期密切相关的蛋白[9]。EGFR可启动细胞生长周期，促进细胞进行有丝分裂，与多种肿瘤细胞的增殖存在关联[10]。非小细胞肺癌A549细胞在接受姜黄素干预后，EGFR蛋白的含量较未接受干预的对照组细胞相比下降明显，且这种下降幅度还与姜黄素的剂量呈显著相关性。P27是一种可抑制细胞分裂和调控细胞周期的蛋白[11]，姜黄素可有效提高肿瘤细胞内该蛋白的表达，从而起到抑制肿瘤细胞进行有丝分裂的作用，且这种作用与姜黄素存在着显著的剂量依赖关系。可认为姜黄素是通过降低肿瘤细胞对EGFR的表达和提高P27蛋白表达的方式来抑制肿瘤细胞增殖。

STIM1和Orai1是钙池操纵的钙离子通道（SOC）家族中十分重要的2种关键分子，其表达量的变化直接导致细胞的炎症、凋亡和基因转录变化[12]。姜黄素可有效降低上述2种蛋白表达量下降，且该效应与姜黄素剂量存在相关性。Caspase-3是Caspase家族中重要的关键分子，是该家族诱导细胞凋亡的关键效应分子[13]，姜黄素可有效诱导该分子，且该作用还与姜黄素的剂量存在相关性。因此，可推测姜黄素是通过上调肿瘤细胞Caspase-3的表达，抑制STIM1和Orai1表达，从而起到诱导细胞凋亡的作用。

姜黄素可有效降低肿瘤细胞侵袭性，这种抑制作用也与姜黄素存在剂量依赖关系。本研究中发现姜黄素可有效降低MMP-9的表达量，提高E-cadherin的表达量，且这种变化也与姜黄素存在剂量依赖关系。E-cadherin是介导细胞互相黏附的跨膜蛋白，其表达下降会导致肿瘤细胞间互相黏附松散导致肿瘤转移概率增大，姜黄素可有效上调肿瘤细胞中该蛋白的表达，加强肿瘤细胞间的黏附力，降低其侵袭性。同时，MMP-9能降解细胞外基质，在肿瘤细胞转移过程中起到了很大作用，姜黄素可有效降低该蛋白的表达量，降低肿瘤细胞的转移能力[14]。认为姜黄素抑制肿瘤细胞转移的机制就是降低肿瘤细胞对于MMP-9的表达提高肿瘤细胞对E-cadherin表达。

本研究结果显示，姜黄素可有效抑制非小细胞肺癌A549细胞的增殖和侵袭，诱导肿瘤细胞凋亡，且与其药物浓度存在剂量依赖关系。随着姜黄素浓度的提高，肿瘤细胞凋亡率、侵袭抑制率和增殖抑制系数都较对照组或剂量较低的实验组有显著升高，这与文献[15]报道相符。本研究中主要是在体外环境下利用A549细胞为载体研究姜黄素对非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响的，但针对在人体环境下姜黄素的药理作用的研究较少，这将是下一步研究的方向。