高效液相色谱法测定咽炎片中木蝴蝶苷B含量

刘保社，曹福麟，曹望弟

（1．陕西欧珂药业有限公司，陕西 商洛 711400； 2．陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；3．陕西省商洛市药品检验所，陕西 商洛 726000）

咽炎片由玄参、百部、天冬、牡丹皮、麦冬、款冬花、木蝴蝶、地黄、板蓝根、青果、蝉蜕、薄荷油等中药组方，具有养阴润肺、清热解毒、清利咽喉、镇咳止痒的功效，用于慢性咽炎引起的咽干、咽痒、刺激性咳嗽等。以往的咽炎片质量控制探讨了黄芩苷、没食子酸、丹酚酸、肉桂酸和芍药苷等的含量测定，并未建立木蝴蝶有效成分的含量测定方法。本研究中参考《中国药典(一部）》[1]及文献[2-16]，采用高效液相色谱（HPLC）法测定咽炎片中木蝴蝶的活性成分木蝴蝶苷B的含量，以有效控制其内在质量。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695高效液相色谱仪（包括2489UV检测器，美国Waters公司）；SQP型电子分析天平（十万分之一，北京赛多利斯科学仪器有限公司）；AS1512560型超声波清洗机（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。

1.2 试药

木蝴蝶苷B对照品（批号为111195-201603，含量为91．9%，中国食品药品检定研究院；咽炎片样品（批号分别为 170701，171102，基片重 0．25 g），不含木蝴蝶的阴性对照品样品，均由陕西欧珂药业有限公司提供；乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasi1100-5 C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-甲醇（B）-0．3% 磷酸溶液（C），梯度洗脱，0～30 min 时 15% →19．5%B、75% →69%C，30 ～40min 时 19．5%B、69%C；流速：0．8mL/min；检测波长：280 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。

2.2 溶液制备

取木蝴蝶苷B对照品适量，精密称定，加50%甲醇，得质量浓度为0．043 2 g/L的对照品溶液；取除去包衣的咽炎片粉末1．24 g，精密称定，置50 mL容量瓶中，加70%甲醇溶液适量，混匀，称定质量，超声20 min，放冷，用70%甲醇溶液定容至刻度，快速过滤，取续滤液，微孔滤膜（0．45 μm）滤过，得供试品溶液；按处方比例，照处方制备工艺制成不含木蝴蝶的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

阴性干扰试验：精密吸取阴性对照品溶液20 μL，注入液相色谱仪。色谱图中，在与对照品溶液木蝴蝶苷B峰相同位置上无色谱峰出现，表明阴性对照无干扰。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察：取2．2项下对照品溶液，分别进样1，2，4，8，12，16，20 μL，测定峰面积，以对照品进样量（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=13 448X-13 147，r=1．000 0（n=7）。结果表明，木蝴蝶苷B进样量在0．04～0．86 μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取2．2项下对照品溶液，进样20 μL，重复进样6次，按拟订色谱条件测定峰面积。结果木蝴蝶苷B峰面积的RSD为2．43%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密吸取供试品溶液20 μL，分别于0，2，4，6，8，12，24 h 时进样，测定峰面积。结果木蝴蝶苷B的RSD为1．97%（n=7），表明供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验：取同一批除去包衣的咽炎片粉末6份，按2．2项下方法制备供试品溶液，进样20 μL，测定峰面积，分别计算含量。结果木蝴蝶苷B含量的RSD为1．39%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的同一批除去包衣的咽炎片粉末1．24 g，精密称定，分别精密加入质量浓度为0．011 g/L的木蝴蝶苷B对照品溶液，按2．2项下方法制备供试品溶液，进样20 μL，测定峰面积，计算回收率。结果见表1。

表1 木蝴蝶苷B加样回收试验结果（n=6）

2.4 样品含量测定

取2批（批号分别为170701，171102）样品，依法制备供试品溶液，按拟订方法测定，结果2批样品中木蝴蝶苷 B 的含量分别为 0．254，0．253 mg/g。

3 讨论

提取方法选择：曾比较药典中加热回流、超声提取等提取方法，考察在不同时间的提取效果及不同浓度的甲醇溶液对样品测定结果的影响。结果表明，选用70%甲醇，超声提取20 min，可充分提取样品中的木蝴蝶苷B，简单易行，提取率较高。

流动相选择：曾对不同流动相体系条件的色谱分离效果分别进行了考察，分别比较甲醇-水、甲醇-水-磷酸、乙腈-甲醇-磷酸溶液为流动相的效果。结果表明，以乙腈-甲醇-0．3%磷酸溶液作为流动相，分离效果较好，故选择其为流动相梯度洗脱。

综上所述，本研究中所建立的HPLC法测定咽炎片中木蝴蝶苷B的含量，操作简便，高效快捷，结果准确，对于咽炎片的质量控制具有积极意义，为该品种质量标准的进一步修订提供了试验依据。