丹参多酚酸盐对脑缺血再灌注损伤大鼠Ang-2的影响

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缺血性脑血管病是常见脑血管病之一，脑缺血区由中心缺血区和周围缺血半暗带组成。缺血半暗带是脑卒中治疗的靶点，若采取有效治疗，可使缺血半暗带濒临死亡脑组织获救[1]。血管生成素-2(angiopoietin-2，Ang-2)是血管生成素家族一员，由血管内皮细胞分泌，参与引发内膜去稳定、打破血管稳定信号、导致血管消退、启动血管形成信号、促进血管形成等[2]。注射用丹参多酚酸盐是从丹参中提取的丹参多酚酸盐类化合物，主要成分是丹参乙酸镁，具有改善微循环、抗栓、抗氧化、抗炎和抑制缺血再灌注损伤等作用[3]。以往研究证实，丹参多酚酸盐能改善大鼠局部脑缺血后脑梗死面积，并可延长低压缺氧小鼠存活时间[4-5]。本实验采用大鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，观察注射用丹参多酚酸盐在大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用，通过检测脑缺血半暗带Ang-2变化，探讨丹参多酚酸盐的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 72只健康雄性SD大鼠(体重330 g左右)，由西安交通大学医学院动物实验中心提供。大鼠昼夜循环光照，自由饮水和进食。

1.2 实验药物及试剂 丹参多酚酸盐(上海绿谷生物公司)；HE染色液(上海化学试剂公司)；兔抗大鼠Ang-2抗体(武汉博士德生物工程有限公司)；山羊抗兔二抗和二氨基联苯胺(DAB)试剂盒购(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.3 大鼠MCAO模型制备及分组 采用改良Longa法[6]，大鼠左侧颈内动脉尼龙线线栓法。颈部正中切口3 cm～4 cm，分离皮下组织，暴露左侧颈总动脉，结扎左侧颈总动脉近心端和远心端，用眼科剪在左侧颈总动脉上剪一斜口，插入栓线，直至遇到阻力且栓线进入18 mm～20 mm，缝合皮下组织及皮肤，建立MCAO模型。局灶性脑缺血采用MCAO 48 h；局灶性脑缺血再灌注采用MCAO 2 h后再灌注48 h(MCAO/R)。Sham组手术步骤同MCAO组，仅不行血管内插入栓线。将大鼠随机分为6组：Ⅰ组(Sham+生理盐水)、Ⅱ组(Sham+丹参多酚酸盐)、Ⅲ组(MCAO+生理盐水)、Ⅳ组(MCAO +丹参多酚酸盐)、Ⅴ组(MCAO/R+生理盐水)和Ⅵ组(MCAO/R+丹参多酚酸盐)。将注射用丹参多酚酸盐溶于生理盐水中，浓度3 mg/mL。每只大鼠腹腔注射2.0 mL～2.4 mL生理盐水或丹参多酚酸盐，注射2日，每日2次。

1.4 神经行为学评分 在大鼠MCAO或MCAO/R后48 h进行神经功能评分，0分：无神经功能缺损症状；1分：提尾时病灶对侧前肢不能完全伸直；2分：向病灶对侧转圈征象；3分：向病灶对侧倾倒；4分：不能自发行走及意识丧失。

1.5 HE染色 神经行为学评分后，将大鼠断头取脑，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋切片，片厚6 μm，将切片置于HE染色液中染色，中性树脂封片。

1.6 免疫组化 将大鼠脑组织在4%多聚甲醛中固定，随后分别在20%、30%蔗糖中存放至沉底。将脑组织包埋，冰冻切片机切20 μm脑片，脑片用丙酮浸泡20 min，磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗3次。再用甲醛30 mL+PBS 10 mL+30% H2O2500 μL浸泡10 min，PBS洗3次。应用二步法进行免疫组化检测：加兔抗大鼠Ang-2抗体(1∶1 000)室温孵育6 h，PBS洗3次，加山羊抗兔二抗，室温孵育1 h，PBS洗3次，DAB显色，裱片，梯度脱水，透明，中性树胶封片。每张切片在高倍视野下随机选取5个视野，观察每个视野Ang-2阳性细胞数，取平均值。

2 结 果

2.1 各组大鼠神经功能评分比较 大鼠神经功能评分显示：Ⅰ组和Ⅱ组大鼠神经学表现基本正常；Ⅲ组和Ⅳ组大鼠神经学评分显著增高(P<0.05)；Ⅳ组评分低于Ⅲ组，差异无统计学意义(P>0.05)；与Ⅲ组和Ⅳ组比较，Ⅴ组和Ⅵ组大鼠神经学评分显著降低(P<0.05)，且Ⅵ组低于Ⅴ组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见图1。

图1 丹参多酚酸盐对大鼠神经功能评分的影响

2.2 各组大鼠神经元病理形态学比较 HE染色显示：Ⅰ组和Ⅱ组大鼠细胞层次清晰，结构和形态正常，细胞胞浆、核染色均匀，间质内未见出血和坏死；Ⅲ组和Ⅳ组大鼠梗死侧皮质有片状坏死，细胞排列松散，形态不规则，细胞深染固缩，胞浆尼氏体消失，胞核固缩，但两组基本无差异。Ⅴ组和Ⅵ组大鼠缺血区有少量灶状坏死，神经细胞固缩程度轻，胞膜及核仁清晰可见，Ⅵ组较Ⅴ组坏死情况减轻。详见图2。

2.3 各组大鼠脑缺血半暗带Ang-2表达比较 免疫组化结果(400×)显示：各组大鼠相关脑区均存在Ang-2阳性表达，Ⅰ组和Ⅱ组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；与Ⅰ组和Ⅱ组比较，Ⅲ组和Ⅳ组Ang-2阳性表达均增加(P>0.05)，且Ⅳ组多于Ⅲ组，结果有统计学意义(P<0.05)；与Ⅰ组和Ⅱ组比较，Ⅴ组和Ⅵ组Ang-2阳性表达均增加(P>0.05)，且Ⅵ组较Ⅴ组增加，差异有统计学意义(P<0.01)。详见图3、图4。

3 讨 论

缺血性脑血管病极大地危害人们健康，脑缺血时存在多种脑损伤疾病的病理生理，因而如何减轻脑缺血后神经损伤，一直是临床研究的重点和难点。临床研究证实，注射用丹参多酚酸盐可改善脑卒中病人神经功能缺损，增加脑血管流量[7]，但其作用机制不明确。本研究通过评估丹参多酚酸盐对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能评分和脑组织病理形态变化的影响，观察丹参多酚酸盐对大鼠急性期脑损伤的神经保护作用，并检测大鼠脑缺血半暗带Ang-2表达，探讨丹参多酚酸盐可能的作用机制。

图2 各组大鼠大脑HE染色

图3 各组大鼠大脑免疫组化染色

图4 丹参多酚酸盐对大鼠脑缺血半暗带Ang-2表达影响

本研究结果显示：大鼠MCAO或MCAO/R后大鼠神经学评分及脑组织病理形态变化均显著增高，而腹腔注射丹参多酚酸盐可改善大鼠MCAO或MCAO/R后大鼠神经学评分及脑组织病理形态变化，且大鼠脑缺血半暗带Ang-2表达高于其他组。正常生理情况下，由于大鼠血脑屏障存在，大多数药物较难通过血脑屏障，但脑缺血性损伤时，其通透性增高，难以通过血脑屏障药物可进入脑组织[8]。有研究指出，局灶性脑缺血后，Ang-2表达上调，与其受体结合，促进微血管生成同时，对血脑屏障产生破坏作用[9]。近年相关研究表明，脑组织损伤后可出现再塑性，神经元发生机制与血管再通有密切关联，因此血管生成为脑损伤修复提供新靶点[10]。血管生成素及其受体酪氨酸激酶受体在脑缺血后微血管生成发挥关键作用[11]。Ang-2影响血管生成与局部微环境有关联，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)存在时，Ang-2破坏已有血管的稳定，加快重塑血管基底膜，从而激活内皮细胞增殖、迁移、血管出芽和平滑肌细胞聚集黏附，形成新的血管[12]。目前已经证实，缺血性脑损伤能上调神经元Ang-2表达[13]，这与本研究结果观察到脑缺血再灌注大鼠中Ang-2表达是一致的。以往动物研究已表明，脑缺血时梗死周边有新生血管生成，2 d～7 d梗死灶周边有毛细血管重建，之后逐渐发展成小血管，并可通过发芽和套叠方式延伸到缺血中心区，在此过程，Ang-2及其受体发挥重要调节作用[14]。本研究中，MCAO介导的脑缺血再灌注大鼠血脑屏障遭到破坏，丹参多酚酸盐通过血脑屏障，到达大鼠缺血半暗带，通过上调该区域Ang-2表达，从而对濒死神经细胞发挥神经保护作用。