响应面法优化草莓鲜榨汁紫外杀菌工艺

胡顺爽，郜海燕*，吴伟杰，陈杭君

（1.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003；2.浙江省农业科学院食品科学研究所，农业部果品产后处理重点实验室，浙江省果蔬保鲜与加工技术研究重点实验室，中国轻工业果蔬保鲜与加工重点实验室，浙江 杭州 310021）

鲜榨纯果汁是指未添加任何配料（包含水）的鲜榨果汁。随着人们生活水平的提高以及保健意识的增加，鲜榨果汁越来越受到广大消费者的欢迎。鲜榨果蔬汁将逐渐发展成为大众化的健康饮品[1]。鲜榨果汁可以尽最大程度保留原有水果中的营养成分[2]。草莓属于蔷薇科草莓属，是浆果类果实，色泽鲜艳、香味浓郁、营养成分含量较高，草莓中的VC、花色苷及总酚等具有很强的抗氧化性，具有一定的保健作用，其次草莓含水量高，果汁含量十分丰富，是制作鲜榨果汁的理想原料[3]。但是草莓果皮薄，组织娇嫩，缺乏坚硬外皮保护，在收获与运输过程中极易受到损伤或遭受微生物侵染，从而降低草莓的商品利用价值。因此将草莓进行榨汁可以提高草莓的综合利用价值。草莓鲜榨汁因为未加入任何防腐剂及添加剂，在生产过程中需要进行灭菌处理，以防止贮藏过程中草莓鲜榨汁被微生物侵染而腐败。

紫外杀菌消毒作为一种有效控制微生物污染的物理冷方法，以其杀菌彻底、无化学残留“绿色”等特点[4]，越来越为广大学者们研究热点。目前，紫外技术已经应用于液体、气体和固体的杀菌，为保障人们的健康生活、提高生活品质发挥着重要作用。紫外杀菌消毒作为一种物理冷杀菌方式，相对于热杀菌来说，主要依靠紫外线照射使得细胞内的DNA发生交联，阻止DNA解旋复制，抑制微生物的繁殖[5]。研究发现紫外可以有效杀灭几乎大部分的微生物[6]。由于杀菌过程中食品温度几乎维持不变，可以最大程度地保持食品的色、香、味及营养成分，并且紫外处理后食品不会留下残留物[7]。Ochoa-Velasco等[8]在实验室利用设计的紫外装置完成对新鲜火龙果汁杀菌，测试了大肠杆菌（Escherichia coli）K12和酵母菌、甲第鞭毛虫（Giardia）和隐孢子虫（Cryptosporidium）的杀菌、杀虫效果。Attic[9]和Matak[10]等利用紫外对牛奶和羊奶进行灭菌，并取得了不错的效果。

本研究主要通过将紫外线灭菌应用于草莓鲜榨汁中，并利用响应面优化其杀菌工艺。主要目的是在草莓鲜榨汁灭菌过程中，尽最大程度减少草莓鲜榨汁营养成分的损失，同时达到国家相关标准的杀菌要求，从而延长其货架期，提高草莓鲜榨汁的商品价值。以期为紫外线技术在液体食品加工中应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原材料“红颊”草莓，采自浙江建德草莓园，摘取成熟度一致、无机械损伤及病虫害的草莓，采摘当天运回实验，4 ℃贮藏备用。

马铃薯葡萄糖（PDA）培养基、酵母浸出粉、胰蛋白胨 上海盛思生化科技公司；牛肉膏 北京双旋微生物培养基制品厂；琼脂粉、氯化钠 国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

HGB500榨汁机 美国Waring公司；icount10全自动菌落计数仪 杭州迅数科技有限公司；Cintra404紫外-可见光分光光度计 澳大利亚GBC科技仪器公司；MLS-3781L高压蒸气灭菌锅 松下健康医疗器械株氏会社；VS-1306超净工作台 苏净集团安泰有限公司；80 目标准检验筛（孔径0.2 mm）、100 目标准检验筛（孔径0.15 mm） 浙江上虞市华丰五金仪器有限公司；PAL-1型数显糖度计 日本爱拓公司；Metrohm 877 Titrinopius自动滴定仪 瑞士万通公司；ArantiJ-E台式离心机 美国Thermo公司。

紫外杀菌装置：MRC-250B智能人工紫外气候箱上海百典仪器设备有限公司；Philips 40 W低压紫外灯。

1.3 方法

1.3.1 草莓鲜榨汁的制备

将草莓进行挑选、去蒂和清洗处理后，用榨汁机进行榨汁，分别用80 目和100 目的标准检验筛进行过筛过滤，再用200 目的滤布进行最后过滤，得到草莓鲜榨浊汁。将草莓浊汁放在4 ℃的冰箱中静置12 h，待其分层后取上清液，即为草莓鲜榨汁[11]。实验过程中为保证结果不受取样的影响，每次实验所需草莓鲜榨汁均一次制作完成，用消毒的玻璃瓶（体积150 mL，瓶口直径4.2 cm，高7.9 cm）分别包装后放置在4 ℃避光保存备用。

1.3.2 紫外杀菌条件单因素试验

1.3.2.1 对照实验

将未经过任何处理的草莓鲜榨汁样品作为对照组，检测其菌落总数、霉菌和酵母的数量，作为本实验的初始值。

1.3.2.2 果汁厚度紫外杀菌率的影响

取6 个经过高温灭菌的培养基（培养皿直径90 mm，下同），通过控制草莓鲜榨汁的体积控制草莓鲜榨汁的厚度，分别将厚度设置为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mm，在紫外气候箱功率40 W、照射时间65 min、照射距离12 cm的条件下进行草莓鲜榨汁的灭菌，测定其在不同果汁厚度下菌落总数、霉菌和酵母的数量，并计算杀菌率。

1.3.2.3 照射距离对紫外杀菌率的影响

取6 个经高温灭菌的培养基，固定果汁厚度1.0 mm，照射距离分别设置8、12、16、20、24、28 cm，紫外气候箱功率为40 W，照射65 min，测定其在不同照射距离下菌落总数、霉菌和酵母的数量，并计算杀菌率。

1.3.2.4 照射时间对紫外杀菌率的影响

取6 个经高温灭菌的培养基，固定果汁厚度1.0 mm、照射距离12 cm、将照射时间分别设置为15、25、35、45、55、65 min，在40 W的紫外线照射下分别考察照射时间对草莓鲜榨汁杀菌率的影响。

1.3.2.5 照射功率对紫外杀菌率的影响

取6 个经高温灭菌的培养基，固定果汁厚度1.0 mm、照射距离12 cm、照射时间55 min，分别在8、16、24、32、40、48 W的紫外线照射功率条件下进行草莓鲜榨汁灭菌，测定其在不同照射功率下菌落总数、霉菌和酵母的数量，并计算杀菌率。

1.3.2.6 微生物指标测定

菌落总数测定参考GB 4789.2—2010《食品微生物学检验 菌落总数测定》[12]，酵母菌和霉菌测定参考GB 4789.15—2016《食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》[13]。杀菌率按下式进行计算：

1.3.3 响应面优化试验

根据单因素试验结果，固定照射功率为40 W，以果汁厚度、照射距离和照射时间为试验因素并以-1、0、1分别为自变量的低、中、高水平，以杀菌率为响应值，设计3因素3水平试验，具体因素与水平见表1。

表1 响应面试验因素及水平Table 1 Code and level of independent variables used for response surface methodology

1.3.4 品质指标测定

1.3.4.1 可溶性固形物

利用手持式数显糖度计测定，读数即为可溶性固形物含量，每个处理组做3 组平行，取平均值。

1.3.4.2 可滴定酸

利用自动滴定仪测定，其含量以柠檬酸体积分数表示。

1.3.4.3 VC含量测定

采用分光光度计法对草莓鲜榨汁进行VC的测定[14]。量取1 mL草莓汁，加入5 mL三氯乙酸溶液（50 g/L），离心，取上清液。取0.5 mL上清液于试管中分别加入20 g/L三氯乙酸溶液1.5 mL，无水乙醇1 mL，4%磷酸-乙醇溶液0.5 mL，5 g/L邻菲罗啉-乙醇溶液1 mL，0.3 g/L三氯化铁-乙醇溶液0.5 mL；对照组以0.5 mL三氯乙酸溶液代替草莓汁上清液，30 ℃反应60 min，于534 nm波长处测定吸光度。

1.3.4.4 花色苷含量的测定

参考胡位荣等[15]方法，采用pH示差法进行草莓鲜榨汁花色苷的测定。取1 mL草莓汁加入5 mL预冷的pH 3、75%乙醇溶液，4 ℃暗室浸提2 h，离心，取上清液。取0.025 mol/L氯化钾缓冲液（pH 1）和0.4 mol/L醋酸钠缓冲液（pH 4.5）各9 mL，加入1 mL上清液混合均匀，以蒸馏水作对照，用分光光度计测定510 nm和700 nm波长处的吸光度。

1.3.4.5 总酚含量的测定

参考李巨秀等[16]方法，采用Folin-Ciocalteau法进行草莓鲜榨汁的总酚含量测定。取1 mL草莓汁加入5 mL 60%乙醇提取液浸提2 h，离心。取1 mL上清液加入25 mL的具塞试管，加入3 mL福林-酚试剂后摇匀静置5 min，分别加入6 mL 7.5%碳酸钠溶液，用蒸馏水定容25 mL，室温下暗处放置2 h，于760 nm波长处测定吸光度。

1.4 数据统计

进行3 次重复实验，并取平行值。响应面数据采用Design-Expert V8.0.6 软件进行统计分析。另外采用Excel 2007、SPSS 22.0对数据进行分析处理，用最小显著性差异（least significant difference，LSD）法多重比较进行差异显著性分析（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 紫外杀菌条件单因素试验结果

图1 单因素对紫外杀菌率的影响Fig. 1 Effect of various factors on sterilization efficiency

新鲜制备的草莓鲜榨汁中菌落总数达到7.2 2×1 02C F U/m L，霉菌及酵母菌总数达到1.17×102CFU/mL，根据国家标准[12]，当果蔬汁中菌落总数超过100 CFU/mL时即超过卫生标准，不符合要求，因此应对草莓鲜榨汁进行杀菌。由图1A可知，紫外对草莓鲜榨汁杀菌效果随着草莓鲜榨汁的厚度增加而下降，两者呈现负相关，草莓汁厚度在增加至1.0 mm以后，杀菌率开始出现下降。当草莓鲜榨汁厚度为1.0 mm时，对菌落总数的杀菌率达到99.46%，霉菌和酵母菌的杀菌率达到100%，当草莓原汁厚度增加至2.0 mm时，对菌落总数、霉菌和酵母菌的杀菌率分别降至94.09%和93%。由于紫外线的穿透力较差，液层厚度对紫外线的穿透率有着较大的影响，随着草莓鲜榨汁厚度的增加，杀菌率降低，主要因为紫外线的穿透率随着液层厚度的增加而降低[17]，紫外线强度减小，杀菌率降低。因此，综合考虑，选取草莓鲜榨汁厚度为1.0 mm比较合适，即选取1.0 mm为响应面优化时自变量果汁厚度（X1）的零水平。

由图1B可知，随着紫外灯照射距离的增加，杀菌率呈现逐渐降低的趋势。当紫外灯照射距离为12 cm时，紫外杀菌对霉菌和酵母菌总数及菌落总数的杀菌率分别为99.46%和100%，照射距离超过12 cm时，杀菌率开始出现下降。紫外照射距离为16 cm时，对霉菌和酵母菌总数及菌落总数的杀菌率分别下降至96.21%和96.03%，紫外灯照射距离为20 cm时，杀菌率开始明显降低，杀菌效果减弱。这是因为紫外线强度系数随距离增加减小从而影响了紫外辐射剂量。照射距离越大，紫外线强度越小，紫外的辐照剂量越小，对微生物的辐照损伤越小，杀菌率越低[18]。因此，综合考虑，选取紫外灯照射距离为12 cm比较合适，即选取12 cm为响应面优化时自变量照射距离（X2）的零水平。

由图1C可知，随着紫外照射时间的延长，对草莓鲜榨汁的杀菌率呈现上升趋势，两者呈正相关。当紫外杀菌时间为15 min时，对霉菌和酵母菌总数、菌落总数的杀菌率分别为80.64%和78.57%。当紫外杀菌时间为55 min时，对霉菌和酵母菌总数、菌落总数的杀菌率分别增加至99.46%和99.2%。杀菌时间超过55 min后，杀菌率虽然有所增加，但是增加比较缓慢，此时草莓鲜榨汁中霉菌和酵母及细菌几乎杀菌完全。照射时间与紫外辐照剂量成正比，杀菌时间越长，辐照剂量越大，杀菌率越高，但是辐照时间的延长会增加生产成本。因此综合考虑，将照射时间55 min为响应面优化时自变量照射距离（X3）的零水平。

由图1D可知，随着紫外照射灯功率的增加，杀菌率呈逐渐增加趋势，当紫外灯功率为8 W时，对草莓鲜榨汁的杀菌率比较低，当紫外杀菌功率增加至16 W时，草莓鲜榨汁的杀菌率明显增加，对菌落总数、霉菌和酵母菌总数的杀菌率分别为92.47%和86.30%。当紫外杀菌功率达到40 W时，杀菌效果逐渐趋于平稳，对菌落总数、霉菌和酵母菌总数的杀菌率分别为99.87%和99.24%。这是因为紫外杀菌率受其辐射剂量的影响，辐射剂量越大，杀菌率越高[19]。综合成本等因素，选取紫外照射功率40 W为响应面优化时自变量照射功率（X4）的零水平。但本实验通过控制紫外灯管数量调节X4水平，平行分布的紫外灯照射强度不够集中，功率准确性差。另外，杀菌容器位于紫外灯管正下方，紫外灯管的数量及中心位置影响杀菌容器位置，从而影响紫外强度和精度。因此，本实验不采用X4零水平。本研究将固定5 根灯管（紫外灯杀菌功率约为40 W），每组实验都固定杀菌容器在5 根灯管中心位置的正下方，以草莓鲜榨汁厚度（X1）、照射距离（X2）、照射时间（X3）作为响应面试验影响因素，从而保障试验的准确性。

2.2 响应面优化对草莓鲜榨汁杀菌结果

2.2.1 响应面优化试验结果与分析

根据单因素试验结果，采用3因素3水平利用Design-Expert V8.0.6软件按照Box-Behnken原理进行响应面设计，根据试验设计确定方案对杀菌率进行优化，试验方案及结果见表2。以菌落总数的杀菌率为响应值，以果汁厚度（X1）、照射距离（X2）、照射时间（X3）作为响应面试验影响因素，方差分析见表3。采用Design-Expert软件对试验数据进行多项拟合回归，得到紫外杀菌率对果汁厚度（X1）、照射距离（X2）、照射时间（X3）的二次多项回归模型方程：Y=99.40-0.96X1-0.7X2+0.67X3+0.33X1X2+0.15X1X3-0.36X2X3-

由表3可知，该模型显著（P＜0.05），失拟项不显著，模拟的相关系数R2值为0.966 7，大于0.9，说明该模型与实际拟合良好，自变量与响应值之间的线性关系显著，可用于草莓原汁紫外杀菌工艺实验的预测[20]。另外，方差分析结果表明，草莓鲜榨汁厚度对响应值菌落总数杀菌率极显著，照射距离、照射时间对响应值影响显著。各因素的F值可以反映出各因素对试验指标的重要性，F值越大，表明对试验指标的影响越大，即重要性越大[21]。结合表3可知，对草莓鲜榨汁杀菌率影响程度大小顺序为果汁厚度＞照射距离＞照射时间。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Box-Behnken design with experimental values of sterilization ef fi ciency

表3 回归方差分析Table 3 Analysis of variance for the fi tted regression model

2.2.2 响应面分析与结果优化

利用Design-Expert软件对回归方程构建响应面分析图，分析各因素对杀菌率的影响，从其等高线可以看出两个自变量之间的交互作用的显著程度，其中圆形表示交互作用不明显，椭圆形表示两个变量之间交互作用明显[22]。

由图2可以看出，果汁厚度与照射时间，照射时间与照射距离交互作用对菌落总数杀菌率的影响具有显著作用。果汁厚度和照射距离交互作用响应面图较为平缓，等高线接近于圆形，因此果汁厚度和照射距离之间的交互影响不明显。

图2 任意两变量对紫外杀菌率影响的响应面与等高线图Fig. 2 Response surface plots and their corresponding contour plots showing the interactive effects of various variables on sterilization efficiency

通过对二次多项式数学模型的解逆矩阵，得出紫外辐照对草莓原汁的最佳杀菌条件为果汁厚度0.73 mm、照射距离8.0 cm、照射时间62.35 min，预测杀菌率为100%。

2.3 验证实验结果

为检验模型预测的准确性，采用响应面优化的工艺条件对草莓原汁进行紫外杀菌，考虑到实际性操作，将最优工艺条件调整为果汁厚度0.7 mm、照射距离8.0 cm、照射时间62 min，进行验证实验，并重复3 次，得到实际杀菌率为99.24%，与预测杀菌率100%非常接近，重复性好，说明该响应面法得到的紫外杀菌最佳工艺条件比较可靠，具有一定的实际指导意义。

2.4 紫外杀菌与巴氏杀菌对草莓原汁理化品质的影响

2.4.1 紫外杀菌对草莓鲜榨汁可溶性固形物和可滴定酸的影响

表4 外杀菌与热力杀菌对草莓鲜榨汁可溶性固形物和可滴定酸的影响Table 4 Effects of ultraviolet and heat sterilization on TSS and TA of strawberry juice

由表4可知，对照、紫外杀菌及巴氏杀菌草莓原汁中可溶性固形物质量分数分别为7.3%、7.3%、7.4%，经过紫外杀菌及巴氏杀菌后的草莓原汁可溶性固形物没有显著性变化。可滴定酸含量经过紫外杀菌含量有所下降，但是下降幅度比较小，经过热力巴氏杀菌后的草莓原汁可滴定酸下降比较大，说明紫外杀菌可以一定程度上缓解草莓原汁中的可滴定酸含量的降解。该结果与焦中高等[23]在短波紫外线辐照处理对采后甜樱桃果实营养品质和抗氧化活性影响结果研究相一致。

2.4.2 紫外杀菌对草莓鲜榨汁VC含量的影响

VC在草莓原汁中含量比较丰富，是草莓原汁中重要的营养物质之一，VC很不稳定，受温度影响比较大，加热容易造成VC的严重损失[24]。如图3所示，用紫外杀菌和巴氏杀菌后的草莓原汁维生素含量都出现下降，未经过处理的草莓原汁中VC含量为50.15 mg/100 g，经过紫外杀菌后VC含量下降为35.19 mg/100 g，VC含量下降29.8%，经过巴氏杀菌后草莓原汁VC含量为20.77 mg/100 g，比未处理草莓原汁下降了57.79%，紫外线杀菌对草莓鲜榨汁VC的破坏程度为巴氏杀菌的48%。主要因为加热可以促进VC的氧化。紫外线照射可以抑制氧化酶的活力，缓解VC的氧化速率，提高VC的保存率，有利于VC的保持[25]。曾报道紫外对橙汁的杀菌实验结果表明紫外线杀菌对橙汁VC的破坏程度为热杀菌的36%[26]。本研究草莓鲜榨汁紫外杀菌对VC的影响与橙汁紫外线杀菌结果相一致。

图3 紫外杀菌对草莓鲜榨汁VC的影响Fig. 3 Effect of UV sterilization on VC content

2.4.3 紫外杀菌对草莓鲜榨汁花色苷含量的影响

图4 紫外杀菌对草莓鲜榨汁花色苷的影响Fig. 4 Effect of UV sterilization on anthocyanin content

草莓鲜榨汁含有丰富的花色苷，草莓中花色苷对热不稳定，容易发生降解。花色苷中的二苯基并吡喃阳离子（AH+）的失电子过程AH+→A是放热反应，水解反应AH+→B和开环反应B→C是吸热反应并且伴随着熵的增大。因此温度升高时，平衡向着无色的甲醇假碱和查尔酮形式转化，花色苷含量降解。由图4可知，未经过灭菌的草莓原汁中花色苷含量为227.17 mg/g，经过巴氏杀菌后的草莓鲜榨汁中花色苷下降为185.24 mg/g，下降了18.46%，因为巴氏杀菌需要加热，温度升高，草莓鲜榨汁里的花色苷受热降解。这与Lise等[27]在草莓花色苷稳定性研究中相一致。经过紫外线杀菌的草莓鲜榨汁，花色苷含量有所升高，含量为251.3 mg/g，与未灭菌的草莓鲜榨汁相比较含量升高了9.6%。因为紫外线可以促进草莓鲜榨汁中花色苷的快速合成和积累。这与焦中高等[23]在短波紫外线在樱桃中应用研究结果相一致。

2.4.4 紫外杀菌对草莓鲜榨汁总酚含量的影响

图5 紫外杀菌对草莓鲜榨汁总酚的影响Fig. 5 Effect of UV sterilization on total phenolic content

由图5可知，草莓鲜榨汁在经过紫外灭菌后和巴氏杀菌后含量都有所上升，含量分别提高了10.7%和6.1%。紫外照射可快速激发草莓鲜榨汁中多酚物质的合成，说明酚类物质含量在短时内的升高可能缘于植物体对紫外线胁迫的快速应激反应，即在短时间内激发了合成酚类物质的苯丙烷代谢途径。Erkan等[28]发现用紫外线照射蓝莓后，在短时间内有利于蓝莓总酚含量的提高。胡丽娜等[29]发现用短波紫外处理山楂果总酚含量与对照相比最高能升高7.28%。另外马玉荣[30]发现经过巴氏灭菌后的豆浆总酚含量升高，解晚晴等[31]发现大豆经过高温加工成豆制品后，比原来大豆的总酚含量增加。这些与本研究的结果相一致。

3 结 论

本研究以紫外为杀菌方法，应用SPSS和Design-Expert软件得出紫外辐照对草莓鲜榨汁的最佳杀菌条件为果汁厚度0.7 mm、照射距离8.0 cm、照射时间62 min，杀菌率为99.24%。另外由于紫外线穿透厚度极小，在实际生产中可考虑采用鲜榨草莓汁在动态的条件下照射，如夹层薄流、喷雾照射等。另外在最佳紫外杀菌条件下，比较了传统热杀菌巴氏杀菌和紫外杀菌对于草莓鲜榨汁品质指标的影响，结果表明，紫外线杀菌对鲜榨草莓鲜榨汁可溶性固形物无显著影响，但紫外杀菌可一定程度地缓解草莓鲜榨汁中可滴定酸在杀菌过程中的降解。另外，经过紫外线杀菌的草莓鲜榨汁中的VC含量有所下降，但是与巴氏杀菌相比较，VC损失率相对较小。经过紫外线杀菌后的草莓鲜榨汁中花色苷和总酚含量都有所增加。说明紫外线杀菌能达到商业无菌前提下，有助于草莓原汁中营养物质的保持。