子宫内膜异位症患者内膜中miR-20b-5p、miR-106a-5p的表达及机制探讨

张 倩，顾成磊，叶明侠，张 哲，孟元光

解放军总医院 妇产科，北京 100853

子宫内膜异位症(endometriosis，EM)被定义为子宫内膜的腺体、间质异位到子宫腔以外部位生长、浸润，是最常见的妇科良性增殖性疾病，影响着6% ～ 10%的育龄期女性，其中存在慢性盆腔痛和(或)不孕的女性占35% ～ 50%，严重影响着女性健康[1]。EM的确切病因尚不明确，但有研究表明增殖与凋亡的分子调节异常是其发生发展的重要环节[2]。微小RNA(MicroRNAs，miRNAs)是一类内源性小分子RNA，不参与蛋白质的编码，主要通过与mRNA的3'UTR(Untranslated Region)结合降解靶mRNA控制人类的蛋白编码基因。已有大量的研究表明，microRNAs在子宫内膜异位症发病的多个环节中起重要的作用。在之前的实验中，我们采用高通量测序的方法在EM患者在位内膜(eutopic endometrial，Eu)及异位内膜(ectopic endometrial，Ec)中筛选出一系列差异表达的microRNAs， 其 中 miR-20b-5p、miR-106a-5p在异位病灶中显著下调，提示可能参与子宫内膜异位症的发病[3]。miR-20b、miR-106a是miR-106a-363基因簇中的成员，两者结构相似，功能相近[4]。据报道，两者均有促进肿瘤细胞增殖效应[5-6]。PTEN不仅是重要的肿瘤抑制基因[7]，其突变或表达缺失也与EM的发生密切相关[1]，其高表达可作为细胞凋亡的标记物。细胞周期蛋白E1(cyclin E1，CCNE1)是细胞周期调节的重要因子，过表达将使细胞处于异常增殖状态，导致多种疾病的发生[8]，CCNE1可以作为细胞增殖的独立预测标志。本实验拟研究miR-106a-5p与miR-20b-5p对子宫内膜异位症细胞增殖与凋亡的影响，我们分别检测了细胞增殖标记CCNE1和肿瘤抑制标记PTEN，并分析它们的相关性。

对象和方法

1 研究对象 选择2017年5月- 2018年5月在本院妇产科行腹腔镜手术及术后病理检查确诊的EM患者30例，年龄(32.4±6.2)岁，采用美国生育学会修订的EM分期标准(r-AFS)进行分期：Ⅰ/Ⅱ期患者3例(月经周期：1例增殖期，2例分泌期)，Ⅲ/Ⅳ期患者27例(月经周期：7例增殖期，20例分泌期)。对照组选择同期行腹腔镜子宫肌瘤剔除术的患者30例，年龄(36.35±5.89)岁。两组患者年龄无统计学差异(P＞0.05)。所选患者均月经规律，排除其他内外科合并疾病，术前3个月内无内分泌药物治疗，术前6个月内无哺乳史。本研究通过院伦理委员会审查并批准，所有入组患者均知情同意。

2 研究方法 获取正常子宫内膜30例、在位子宫内膜30例及异位子宫内膜组织37例，分别检测 miR-106a-5p、miR-20b-5p、CCNE1、PTEN 的表达，探讨它们在内异症内膜组织中的表达模式及rAFS和内膜周期对它们表达的影响，同时研究miR-20b-5p、miR-106a-5p对子宫内膜异位症细胞增殖与凋亡的影响。

3 实验方法 1)标本的获取：无菌操作下，从30例EM患者中获得37例内异症异位内膜组织(其中1例为双侧卵巢子宫内膜异位囊肿，4例合并腹膜EM，2例合并深部浸润型EM，故不同病灶分别取材)，标本离体后立即取1 cm2大小组织，冻存于液氮。2)总RNA的提取及mRNA的qRT-PCR：用TRIzol(美国invitrogen)试剂提取组织总RNA，用NanoDrop微量分光光度计(美国Thermo)检测总RNA质量，OD260/OD280=1.8-2.0、OD260/OD230＞2.0为合格样品。将合格总RNA逆转录，使用cDNA第一链逆转录合成试剂盒(美国Thermo)进行，荧光实时定量PCR反应用qPCR预混试剂(日本TOYOBO)进行，实验步骤均按照相关试剂说明书严格进行。PTEN、CCNE1扩增引物序列参见文献[9]，以β-actin为内参。扩增条件：95℃1 min 1个循环，94℃15 s、60℃30 s、72℃40 s 45个循环。3)miRNA的qRT-PCR：采用茎环特异性引物法进行逆转录[10]，其他步骤同mRNA。茎环逆转录引物序列：miR-20b-5p，GTCGTAT CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATAC GACCTACCTG；miR-106a-5p，GTCGTATCCAGT GCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACG ATGGAC。得到cDNA模板，对cDNA模板进行qPCR反应。引物序列，miR-20b-5p上游：5'-GCTGCAAAGTGCTCATAGTG-3'，miR-106a-5p上游：5'-CGTGACAAAAGTGCTTACAGTG，下游通用引物序列：5'-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3'。以U6为内参。扩增反应条件：95℃1 min 1个循环，94℃15 s、55℃30 s、72℃40 s 45个循环；每个样本重复3次。表达水平采用相对定量2-△△CT方法计算得出。

4 统计学方法 采用SPSS21.0软件进行统计学分析。计量资料经正态性检验，不满足正态分布的资料应用Mann-Whitney U检验及Kruskal-Wallis H检验，两两比较结果采用调整显著性后的P值。满足正态性的采用t检验及单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。MiR-106a-5p、miR-20b-5p与PTEN、CCNE1表达水平的相关性采用Pearson相关分析。P＜0.05 (双侧)为差异有统计学意义。

结 果

1 三组组织标本中相关指标比较 Ec与Eu相比，miR-20b-5p(0.26±0.24 vs 0.92±0.40)、miR-106a-5p(0.78±0.37 vs 1.79±0.68)表达量均显著下降(P均＜0.001)；PTEN mRNA(2.34±1.27 vs 0.92±0.35)的表达量显著上升(P＜0.001)；CCNE1 mRNA(0.78±0.35 vs 1.12±0.44)的表达量显著下降(P=0.005)；Eu与N相比，miR-20b-5p(0.92±0.40 vs 0.56±0.23)表达量显著上升(P=0.038)；PTEN(0.92±0.35 vs 1.28±0.36)表达量显著下降(P=0.049)，miR-106a-5p(1.79±0.68 vs 1.33±0.52)及 CCNE1(1.12±0.44 vs 1.35±0.53)的表达未见明显差异(P＞0.05)。见图1。

2 异位内膜组织标本中rAFS分期、内膜周期对相关指标表达的影响 异位内膜组织标本中，未发现miR-20b-5p、miR-106a-5p、PTEN、CCNE1的表达在不同rAFS分期及不同内膜周期中存在统计学差异(P均＞0.05)。见表1和表2。

图1 MiR-20b-5p、 miR-106a-5p、 PTEN、 CCNE1在三组表达的比较Fig. 1 Comparison of expression levels of miR-20b-5p, miR-106a-5p, PTEN, CCNE1 in three groups

3 MiR-20b-5p、miR-106a-5p与PTEN表达水平的相关性 MiR-20b-5p与PTEN mRNA在在位内膜(r=-0.63，P＜0.001)及异位内膜(r=-0.42，P=0.01)中的表达均呈负相关；miR-106a-5p与PTEN mRNA的表达在在位内膜(r=-0.14，P=0.465)及异位内膜(r=-0.25，P=0.142)中均不存在相关性。

表1 不同rAFS分期异位内膜中microRNA和mRNA的表达Tab. 1 Expression of microRNA and mRNA in Ec group for different rAFS

表2 不同内膜周期患者异位内膜中 microRNA和mRNA的表达Tab. 2 Expression of microRNA and mRNA in Ec group for different menstrual cycle

讨 论

已有证据表明子宫内膜异位症中大量miRNAs存在差异表达，其中包括miR-183、miR-200b、miR451、miR-29c、miR-196、miR-23 等[11-14]。它们参与调节内异症的细胞生长、黏附、侵袭、迁移及凋亡等生物学过程[15]。成熟体序列miR-20b-5p位于性染色体Xq26.2，该区域为染色体脆性区域，其突变与人类多种肿瘤的发生相关[5]。miR-106a-5p与miR-20b-5p同属miR-106a-363基因簇中的成员，已被证实在多种肿瘤性疾病中存在差异表达[6,16]。有研究表明miR-106a-5p是肿瘤发生发展中的重要调节子，其过表达能上调FAS凋亡途径[17]。然而，二者在EM发生中的作用尚不得知。

本研究发现，异位内膜与在位内膜相比，PTEN mRNA的表达升高，CCNE1的表达降低。分析原因可能是EM是一种逐步进展的疾病，早期异位病灶中细胞增殖活力增强，晚期异位病灶组织发生反复出血，导致压迫及坏死，病灶组织纤维化，细胞增殖活力减弱，而本实验中选取病例多数属于晚期。

本研究还发现，异位内膜组织较在位内膜miR-20b-5p的表达减少，PTEN mRNA的表达增加；在位内膜组织较正常内膜miR-20b-5p的表达增加，PTEN mRNA的表达减少，且miR-20b-5p与PTEN mRNA的表达呈负相关关系，提示在位内膜有更强的增殖能力，而凋亡能力减弱，这有利于子宫内膜的异位存活。有文献报道PTEN mRNA是miR-20b-5p的靶基因之一，能够在转录后水平抑制其表达且miR-20b-5p能够明显促进前列腺癌细胞的增殖及转移[5,18]。上述结果均表明miR-20b-5p可能通过调节PTEN的表达，影响细胞增殖，从而在子宫内膜异位症发病中发挥重要作用。

有研究表明，PTEN是miR-106a-5p的直接靶基因。而本研究中，异位内膜组织较在位内膜组织miR-106a-5p的表达量明显下降，PTEN的表达升高，但未发现两者之间存在明显的相关性。miR-106a-5p在EM中的具体作用机制有待进一步验证。

综上，异位内膜较在位内膜miR-20b-5p和miR-106a-5p表达明显下降，在位内膜较正常内膜miR-20b-5p表达明显升高、miR-106a-5p的表达无明显差异。在异位及在位组织中miR-20b-5p与PTEN的表达呈负相关关系。提示miR-20b-5p可能通过PTEN上调细胞增殖，促进EM的发病。miR-20b-5p可能成为EM潜在治疗位点。