猪膀胱细胞外基质对人脐带Wharton胶间充质干细胞生物相容性实验

王 冰，黄靖香，卢世璧，彭 江

1首都医科大学密云教学医院，北京 101500；2解放军总医院 骨科研究所/北京市再生医学重点实验室/全军战创伤重点实验室，北京 100853

许多疾病可使膀胱丧失功能，如癌症、创伤、先天性疾病等，临床常采取肠代膀胱等手术治疗方法，但存在感染、梗阻、黏液分泌、电解质紊乱、穿孔等问题。早在1994年，Cilento等完成了体外泌尿系移行上皮细胞的大规模扩增，至此揭开了组织工程膀胱研究的序幕[1]。随着组织工程技术的进步，出现了组织工程尿道[2]、膀胱[3]等在泌尿外科领域的临床应用。组织工程技术包含支架材料、种子细胞和生长因子。天然膀胱细胞外基质(bladder accellular matrix，BAM)是较好的支架材料，含有的胶原和弹性纤维等利于细胞黏附生长。本实验研究采用化学脱细胞法制备的猪膀胱细胞外基质作为支架材料，复合人脐带WJ-MSCs，探索二者之间的相容性，为组织工程膀胱的研究探索新的种子细胞。

材料和方法

1 实验动物及材料 选取巴马香猪6只，购自解放军医学院医学动物中心，体质量15 kg左右，雄性。本研究经解放军总医院动物伦理委员会审批。DMEM培养基(Hyclone，美国)；PBS缓冲液(Hyclone公司，美国)；0.05%胰酶(Gibco，US)；胎牛血清(Gibco，美国)；Ⅱ型胶原酶(Sigma，美国)；青/链霉素(双抗)混合液(Gibco，美国)；MTT试剂(美国Sigma公司)；聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)(北京方润生物公司)；十二烷基硫酸钠(SDS)(美国Sigma公司)。

2 猪膀胱细胞外基质(PBAM)的制备及鉴定 取实验用香猪的新鲜膀胱6枚置于无菌瓶中(图1A)，去除周围脂肪、筋膜等组织。对照组：无菌PBS反复洗涤后取1 cm×1 cm膀胱组织做冷冻切片，并行HE、甲苯胺蓝和Hoechst33258染色。实验组：将预储存-20℃冰箱内的膀胱置于氧化还原酸化水中，漂洗3次，随后置于-20℃低渗冻存。然后将其浸泡于3%过氧化氢溶液中，置摇床，直至变白。加入1% SDS溶液(pH=9)，置摇床，定时换液。重新置入6% Triton X-100(pH=9)，置摇床至膀胱呈白色(图1B)。取脱细胞后的膀胱组织(1 cm×1 cm)做冰冻切片，设为实验组，同法行三种染色后观察。将PBAM行冷冻干燥机冻干后置于4℃备用。

3 透镜及扫描电镜观察PBAM 以扫描电镜(Hitachi S-4800)观察PBAM结构，以无水乙醇法测孔隙率，每块PBAM测试3次，然后取平均值。

4 人脐带WJ-MSCs的分离、培养及成脂、成骨诱导 人脐带由解放军总医院产科提供，已征得产妇及家属书面同意。实验完全符合国务院颁布的《医疗机构管理条例》相关规定[4]。将脐带以75%乙醇消毒(图2A)，0.9%氯化钠注射液洗涤后剪成3段，完整剔除脐带内2根动脉和1根静脉(图2B)。将Wharton胶撕下置入培养皿中反复洗涤，再移入锥形瓶后离心6 min(1 700 r/min)，离心后弃去洗涤液。Wharton胶中加入DMEM培养液，将Wharton胶剪成1 ～ 4 mm3微小组织匀浆块。加入DMEM培养液，接种于培养皿，置入细胞培养箱。倒置显微镜下观察细胞生长情况，以1∶2比例传代。取P3代人脐带WJ-MSCs分别按照成脂、成骨相应方法进行诱导分化。诱导完成后采用油红O、茜素红染色，倒置显微镜下观察。

5 细胞增殖实验 按国家生物材料评价标准制备PBAM浸提液，实验组将包含10% FBS的25%、50%和100%浓度的PBAM浸提液培养细胞，对照组以DMEM培养细胞。将密度为1.5×105/ml的人脐带WJ-MSCs接种于96孔板上，分别与25%、50%和100%浓度的浸提液和对照组DMEM培养液进行培养。将第1天的孔内加入MTT溶液培养4 h，加入DMSO溶液，酶联免疫检测仪于570 nm条件下测定吸光度(A)值。第2 ～ 6天同样处理并测定，最后记录并绘制增殖曲线。另外，取将1×106/ml密度的人脐带WJ-MSCs悬液接种于6孔板内的PBAM表面，共9孔为实验组；以相同细胞密度悬液单纯接种于6孔板内，共9孔为对照组，全部置入培养箱中，第3、5、7天取材，每次每组各取3个孔，以酶消化法收集细胞计数后进行比较。

6 细胞-支架复合物的相容性观察 PBAM的6孔板接种1×106/ml密度的细胞悬液，培养后分别于第5、7、9天取材，冷冻切片后行Hoechst33258及AO染色，于荧光显微镜下观察。同时将第5天的细胞-支架复合物以10%戊二醛固定，行扫描电镜(SEM)观察WJ-MSCs在PBAM上的生长情况。

7 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析。全部数据以-x±s表示，组间比较采用重复测量方差分析，P＜0.05差异有统计学意义。

图1 PBAM制备 A:新鲜猪膀胱外观; B:脱细胞膀胱; C:冻干的PBAMFig. 1 PBAM preparation A: appearance of fresh porcine bladder; B: acellular bladder; C: lyophilized PBAM

图2 人脐带Wharton胶A：人脐带外观，B：Wharton胶, 2根动脉和1根静脉Fig. 2 Human umbilical cord Wharton glue A: appearance of human umbilical cord; B: Wharton glue, two arteries and one vein

图3 两组分别进行3种染色，对照组见明显细胞核排列，而实验组则未见细胞残留Fig. 3 The two groups were stained with three kinds of dyeing. The nucleus of the control group was obviously arranged, but there was no cell residue in the experimental group

结 果

1 PBAM的观察及鉴定 HE染色：实验组可见大量淡粉色的胶原纤维，未见被蓝染的细胞核，对照组可见大片排列整齐被蓝染的细胞核。甲苯胺蓝染色：实验组未见被蓝染的细胞核，可显示膀胱组织富含碱性黏多糖，对照组可见大片被蓝染的细胞核。Hoechst33258染色：实验组未见被蓝染的细胞核残留，对照组可见排列整齐、分布均匀且被蓝染的细胞核(图3)。

2 透镜及扫描电镜观察(SEM)PBAM 光镜下可见PBAM为多孔材料，孔隙致密，孔隙间交互贯通(图4A)。SEM扫描可见PBAM外层表面大小不一的孔隙，内侧面可见较多褶皱，粗糙不平(图4B)。经无水乙醇法检测PBAM的孔隙率约为93%。

3 人脐带WJ-MSCs形态观察 Wharton胶组织块培养4 d后可见干细胞爬出较多，第6天可见大量呈鱼群状细胞排列生长，高倍镜下观察细胞形态略呈三角状或成纤维状，细胞体积大且细胞核不规则，核仁明显，排列紧密(图5)。

图4 PBAM形态A：透镜下的PBAM，可见较多孔隙，以及相互贯通； B：SEM下呈大小不同的多个孔隙(×1 000)Fig. 4 PBAM under the perspective electron microscopy and SEM A: pores and interpenetration can be seen； B: multiple pores with different sizes (×1 000)

图5 WJ-MSCs形态 A：培养4 d后干细胞从组织块内爬出(×100)； B：WJ-MSCs呈多边形或三角形(×100)； C：培养6 d后呈鱼群样生长(×100)Fig. 5 WJ-MSCs morphology A: at 4 days after culture, stem cells crawled out of the tissue block (x 100); B: WJ-MSCs showed polygon or triangle shape (×100); C: fibroblast-like growth (×100) at 6 days after culture

图6 人脐带WJ-MSCs成脂、成骨诱导A：成脂诱导油红“O”染色，可见大量的脂滴形成(×100)； B：成骨诱导茜素红染色，可见许多钙化点，以及高倍镜下的黑色钙结节(×100)Fig. 6 WJ-MSCs adipogenic and osteogenic induction A: oil red staining for adipogenic induction (×100); B: alizarin red staining for osteogenic induction(×100)

图7 不同浓度PBAM浸提液对人脐带WJMSCs增殖的影响Fig. 7 Effects of different concentrations of PBAM extracts on the proliferation of human umbilical cord WJ-MSCs

4 人脐带WJ-MSCs的成脂、成骨分化诱导结果及鉴定 P3代人脐带WJ-MSCs成脂诱导后行油红O染色，镜下见WJ-MSCs堆积形成脂滴(图6A)；而成骨诱导液培养后行茜素红染色，镜下见许多散在钙化点，高倍镜下可见黑色钙结节(图6B)。

5 细胞增殖实验 不同浓度浸提液组与DMEM组的吸光度(A)值进行比较，结果显示不同浓度浸提液与DMEM对人脐带WJ-MSCs的增殖无统计学差异(P＞0.05)(图7)。将1×106/ml密度的人脐带WJ-MSCs培养至第3、5、7天，以酶消化法收集3个时间段的细胞进行计数，结果显示两组细胞的增殖高峰均在培养的第5天，实验组的细胞增加率高于对照组(P＜0.05)(见表1)。

6 细胞-支架复合物活性观察 复合物培养至第5天后，行Hoechst33258染色见PBAM上有大量黏附生长的WJ-MSCs，且细胞核呈蓝染(图8A)，AO染色提示PBAM上可见大量活细胞(图8B)。扫描电镜观察第5天的细胞-支架复合物，在PBAM的表面可见大量迭连排列的WJ-MSCs，孔隙间也有大量WJ-MSCs黏附、生长，分布于PBAM表面，细胞周边发出伪足样突起黏附PBAM上 (图 8C，图 8D)。

表1 实验组与对照组细胞计数Tab. 1 Cell count in experimental group and control group(×105)

讨 论

近些年，随着组织工程皮肤的产业化，以及组织工程膀胱和尿道的临床应用，人脐带WJMSCs在疾病的治疗和损伤组织修复中发挥了巨大作用[5]。张玉石等[6]采用化学去细胞法制备了PBAM，按不同比例部分修补了犬膀胱缺损，结果证实化学法制备的PBAM具有较好的生物安全性。本研究制备的PBAM经化学脱细胞处理后，行3种染色提示脱细胞效果满意，且该方法保留利于种子细胞黏附生长的成分。Farhat等[7]对PBAM进行了研究显示其存留有Ⅰ、Ⅲ型纤维胶原蛋白，而且弹性蛋白、层黏连蛋白和纤连蛋白仅略有减少，其余肌动蛋白、肌凝蛋白和波形蛋白等仍存在，PBAM仍维持其机械特性。本研究通过扫描电镜可见外层表面大小不一的孔隙，内侧面可见较多褶皱，粗糙不平，测定其孔隙率为93%，适合种子细胞的黏附生长。

间充质干细胞的扩增和分化是随着细胞生长环境的外部信号和微环境的改变而变化的。本研究从人脐带Wharton胶中分离培养出的间充质干细胞，通过形态学观察和生物学特性的鉴定，成功诱导其进行多向分化，如成骨、脂肪细胞等，与研究报道结果一致[8-10]。田洪榛等[11]研究发现18个月内经冠状动脉移植WJ-MSCs可改善缺血性心衰患者左心室功能，24个月时仍提高了患者活动耐量及生活质量，且安全有效。Yuan等[12]收集第1 ～ 5代膀胱平滑肌细胞培养液上清，配制成条件培养液成功诱导WJ-MSCs定向分化为膀胱平滑肌细胞。人脐带WJ-MSCs来源于医疗废弃的人脐带，易获得，常规培养即可，且具有间充质干细胞的生物特性，是较好的干细胞治疗及种子细胞的选择，也被用来进行临床疾病的治疗[13]。

图8 细胞-支架复合物 A：培养第5天后行Hoechst33258染色(×100)，可见大量被蓝染的细胞核，且排列整齐； B：AO染色(×100)，PBAM表面有大量活细胞，呈亮红色； C：培养第5天的SEM结果(×1 000)，可见PBAM表面黏附有大量人脐带WJ-MSCs； D为局部放大2 000倍，可见伸出多个类似伪足样突起黏附于PBAM表面Fig. 8 Cell-Scaffold complex A: at the 5 days after culture, Hoechst33258 staining (×100) showed a large number of blue stained nuclei and they arranged orderly; B:AO staining (×100)showed a large number of living cells on the surface of PBAM with bright red color, C: at the 5 days after culture (×1 000), a large number of human umbilical WJ-MSCs adhered to PBAM surface, D for local amplification of 2 000 times, showed a number of pseudo foot like projections were sticking to the surface of PBAM.

Chen等[14]将猪内皮祖细胞与BAMG复合，同时外源性给予血管生成因子(VEGF)后发现，VEGF可以提高结合内皮祖细胞的BAMG的新血管形成，可作为增加组织工程膀胱血供的适宜途径。而且Hsieh等[15]研究发现人脐带WJ-MSCs比骨髓MSC更具血管再生能力，以及对神经的保护作用。高红亮和易发现[16]研究发现利用大鼠膀胱无细胞基质负载大鼠骨髓间充质干细胞在体外成功构建组织工程膀胱复合物。王琼等[17]膀胱脱细胞基质-丝素蛋白双层支架经皮下预制处理后，修复大鼠膀胱扩大术后膀胱缺损的效果满意。本实验采用人脐带WJ-MSCs作为种子细胞复合PBAM支架材料，PBAM浸提液对细胞增殖的影响与对照组DMEM培养液无明显差异(P＞0.05)，说明化学法制备的PBAM无细胞毒性，且可促细胞增殖。目前由于PBAM的制备还无统一标准，而其生物安全性的相关检测还需进一步完善。Li等[18]证实人脐带WJ-MSCs能够表达前列腺特异性抗原，表明其在泌尿系统中的应用潜能。本实验观察到人脐带WJ-MSCs进入PBAM孔隙内，且很快变形为多边形，伸出类似伪足黏附于PBAM上，自身分泌的细胞外基质也促进其黏附、增殖及分化，成功制备了细胞-支架复合物补片。该实验为后期体内试验提供研究基础，也为组织工程膀胱的研究提供了新的种子细胞。