细鳞鱼嗜水气单胞菌LAMP快速检测方法的建立

郭玉丹 杜迎春 何亚鹏 时 晓 贾 斌

（1.石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003；2.北京市水生野生动植物救护中心，北京 102101）

细鳞鱼（Brachymystax lenok）属鲑形目，鲑科，细鳞鱼属，是我国名贵的陆封型冷水鱼。1988年，细鳞鱼被列入国家二级保护野生动物名录。近年来野生细鳞鱼分布范围逐渐缩小，野生种群急剧衰退，北京已经濒临灭绝。

为了恢复细鳞鱼这一珍稀的濒危物种，人们陆续开展了细鳞鱼的驯养、繁育及增殖放流工作，并取得了初步的成功。但在细鳞鱼的人工驯养过程中，各种疾病频发，尤其是各类细菌性疾病高发，一旦发病很难根治，经常会造成毁灭性后果，造成严重经济损失。因此，在驯养繁育中，迫切需要一种快捷、简便的方法对病源菌进行准确、快速的诊断，对疫病进行早期预防和治疗。

本研究的目的就是将LAMP技术应用到细鳞鱼细菌性疾病的诊断中来，建立一种快速、准确、高效的检测方法。

1 试验材料

1.1 菌株 嗜水气单胞菌,由北京市水生野生动植物救护中心分离培养。

1.2 试验仪器 PCR扩增仪（上海依科赛生物制品有限公司），超净工作台（苏州尚田洁净技术有限公司），凝胶成像仪（上海依科赛生物制品有限公司），超纯水系统（优普）1.3 试验试剂 细菌微量生化鉴定管（北京陆桥技术股份有限公司），药敏纸片（北京天坛药物生物技术开发有限公司），BstDNA链置换聚合酶及缓冲液Buffer（美国纽英伦生物技术），细菌基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司出品），SYBER Green I核酸染料（北京百泰克生物技术有限公司）。

2 试验方法

2.1 细菌DNA的提取 利用天根生化科技有限公司生产的细菌基因组DNA提取试剂盒，对待测菌株的新鲜纯培养液进行细菌总DNA 提取（按说明书操作）。

2.2 LAMP引物的设计合成 NCBI上公布的嗜水气单胞菌pilin基因序列设计引物，利用在线引物设计软件Primer Explorer V4（http://primerexplorer.jp/e/）设计完成（表1）。设计好的引物提交华大公司进行合成。

2.3 LAMP反应体系的建立 外引物的反应浓度为5 pmol，内引物的浓度为40 pmol，环引物的浓度为40 pmol。缓冲液的浓度为2.5 mol/L,镁离子的浓度为150 mmol/L，dNTP的浓度为10 mmol/L，BstDNA链置换聚合酶的浓度为8 U，模板为2 μL，补加去离子水至25 μL（表2）。63.5 ℃水浴锅孵育，然后用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。

表1 嗜水气单胞菌（Ah-1）LAMP引物序列

表2 LAMP方法的反应体系

2.4 LAMP反应的特异性分析 利用设计合成的LAMP引物为模板；同时利用杀鲑气单胞菌、豚鼠气单胞菌、维氏气单胞菌其他3种单胞菌作为模板检测LAMP引物的特异性。同时，设置以ddH2O为模板的阴性对照。

2.5 LAMP反应的灵敏性分析 利用外引物F3和B3，扩增嗜水气单胞菌的Pilin基因。扩增产物进行纯化回收后，用ND2000超微量核酸分析仪测其DNA浓度。然后对扩增产物进行10倍倍比稀释，均匀稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10。 分 别 用 10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2浓度的 DNA 为模板，并设置ddH2O为阴性对照。进行LAMP灵敏性试验。

3 结果与讨论

3.1 LAMP方法的特异性 利用嗜水气单胞菌的Pilin基因设计的LAMP引物进行特异性分析。Pilin引物能够特异性扩增嗜水气单胞菌的靶基因见图1。阴性对照均没有出现非特异性扩增，表明引物特异性良好。

图1 嗜水气单胞菌（Ah-1）LAMP方法的特异性

结果显示：嗜水气单胞菌株反应结果为阳性（+），肉眼观察反应物呈黄色。杀鲑气单胞菌、豚鼠气单胞菌、维氏气单胞菌等3株其他对照菌株反应为阴性（－），反应物呈橙色（染料本身的颜色）；ddH2O对照亦是阴性（－）。说明嗜水气单胞菌LAMP方法的特异性良好。

3.2 LAMP方法的灵敏性 利用ND2000核酸分析仪检测Pilin的原始DNA浓度。对DNA进行10倍倍比稀释以后，分别用 10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2浓度的DNA为模板，进行LAMP反应，然后检测结果见图2。

图2 嗜水气单胞菌（Ah-1）LAMP方法的灵敏性

结果显示，在63.5 ℃的恒温条件下，嗜水气单胞菌最小检出浓度是10-6ng/μL。

3.3 讨论 嗜水气单胞菌是细鳞鱼驯养繁育中的高发致病菌，一旦发病，难以根治，经常会导致重大的经济损失。在细鳞鱼的人工驯养中，迫切需要一种快捷、简便的方法对病源菌进行准确、快速的诊断，用于疫病的早期预防和治疗。

本研究将LAMP技术运用到嗜水气单胞菌的快速检测中来。筛选嗜水气单胞菌的Pilin基因设计特异性LAMP引物，在63.5 ℃的恒温条件下，嗜水气单胞菌的最小检出浓度分别为是10-6ng/μL。结果发现，该方法特异性好，灵敏度高，可将病源的检测时间控制在1 d以内。该方法所需仪器简单，1台水浴锅或恒温箱就能完成反应。结果通过肉眼观察反应沉淀的颜色即可进行判定，特别适合基层疫病的快速诊断，具有非常实用的应用价值。