LC-MS／MS法同时测定益气补血口服液中4个成分的含量

张敏新 ，王书林 ，余宇燕

（1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.南京军区福州总医院，福建 福州 350025）

益气补血汤是我院中医科专家长期在临床使用的验方，本处方主要由黄芪、当归等8味中药组成，具有益气生血、补肾填精，促进因放化疗引起的骨髓功能损伤的修复及调整机体免疫的功效。适用于放、化疗后白细胞减少，贫血及免疫功能低下者［1］。临床验证表明该方疗效显著，安全性好。为了提高患者的顺应性，将其制成口服液，使其更便于服用、保存、运输。本研究采用高效液相色谱-质谱联用技术（LC-MS／MS），通过多反应离子监测（multiple reaction monitoring，MRM）对处方中的君药黄芪、当归及臣药白芍、淫羊藿中的淫羊藿苷、芍药苷、阿魏酸和黄芪甲苷等4个成分同时进行含量测定。本方法具有检测时间短、分离度好的特点，亦可以避免性质相近的化学成分相互干扰，且 LC-MS／MS检测灵敏度高，不受化合物生色基团的限制，更适于中药样品中多组分的同时测定［2-3］。本方法的建立可为益气补血口服液的质量控制提供参考，提高高效液相色谱方法的检测效率，缩短分析时间。

1 仪器与试药

1.1 实验试药 黄芪甲苷（110781-201314，含量测定用）、淫羊藿苷（110737-200415，含量测定用）、芍药苷（110736-201337，含量测定用）、阿魏酸（110773-201313，含量测定用）均购自中国食品药品检定研究院；益气补血口服液及其阴性口服液均为自制；甲醇、乙腈（色谱纯，美国 Fisher公司）、95%乙醇（医用酒精，山东利尔康医疗科技股份有限公司）；甲酸、乙酸铵（色谱纯，迪马科技）。

1.2 实验仪器 岛津30A液相色谱仪［LC-30AD二元泵、SIL-30AC自动进样器、CTO-20A柱温箱，岛津企业管理（中国）有限公司］；AB Sciex Qtrap 5500三重四极杆质谱仪（美国AB公司）；KQ-800KDE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DC215CD十万分之一电子天平、SE6001F电子天平［奥豪斯仪器（上海）有限公司］，RE-5203旋转蒸发仪（上海亚荣公司）。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品储备液 分别取芍药苷、阿魏酸、淫羊藿苷和黄芪甲苷对照品适量，精密称定，以70%甲醇水溶解并分别制成含芍药苷102.4μg／mL、阿魏酸 108.0 μg／mL、淫羊藿苷 282.9 μg／mL 和黄芪甲苷105.9μg／mL储备液，摇匀，即得。

2.1.2 供试品溶液制备 精密吸取样品溶液5.0 mL，置于25 mL量瓶中，加70%甲醇水约10 mL，超声处理5 min，放至室温，以70%甲醇水稀释至刻度，摇匀，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 阴性样品溶液 按益气补血口服液制备工艺，分别制备缺白芍、黄芪、淫羊藿及同时缺当归和党参的阴性溶液。按照“2.1.2”项方法制备各阴性对照溶液，即得。

2.2 色谱-质谱条件色谱条件 色谱条件：采用phenomenex Kinetex C18色谱柱（4.6 mm×100 mm，2.6 μm），柱温 40 ℃，以乙腈-0.2%甲酸、1 mmol／L乙酸铵水溶液为流动相，梯度洗脱（0～1 min，30%乙腈；1～10 min，30%乙腈→70%乙腈），流速 0.4 mL／min，进样量5μL。质谱条件：采用电喷雾离子源（ESI），气帘气压力 20.0 psi，加热气温度为 550℃，辅助气压力60.0 psi，雾化气压力55.0 psi，电压为5 500 V（正离子模式）、-4 500 V（负离子模式）。芍药苷、阿魏酸、淫羊藿苷以负离子扫描方式，黄芪甲苷以正离子扫描方式MRM模式，4个主要成分的质谱参数见下表 1，供试品及阴性样品的总离子流图谱见图 1。

表1 4个分析物的质谱参数

图1 混合对照品（A）、供试品（B）、缺白芍阴性样品（C）、缺当归阴性样品（D）、缺淫羊藿阴性样品（E）、缺黄芪阴性样品（F）总离子流图

2.3 线性关系考察 取对照品储备液适量，加70%甲醇水稀释制成系列浓度的混合对照品溶液，进样，测定。以对照品质量浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归，得到线性回归方程及相关系数，结果表明 4个成分在相应的范围内线性关系良好，见表 2。

表2 各成分线性关系

2.4 精密度试验 制备中间浓度混合对照品溶液，连续进样6次，测得芍药苷、阿魏酸、淫羊藿苷、黄芪甲苷峰面积的RSD分别为1.89%、0.86%、1.45%和4.84%，表明仪器的精密度良好。

2.5 重复性试验 按“2.1.2”项下方法制备同一批样品（批号180110）的供试品溶液 6份，进样测定。结果芍药苷、阿魏酸、淫羊藿苷、黄芪甲苷的平均含量分别为 1.93、0.25、0.66、0.13 mg／mL，RSD 分别为4.7%、4.0%、2.2%、4.4%，表明本方法的重复性良好。

2.6 稳定性试验 取“2.1.2”项下同一份供试品溶液，分别于 0、2、4、8、12 h 进样测定，测得芍药苷、阿魏酸、淫羊藿苷、黄芪甲苷峰面积的RSD分别为2.31%、1.14%、1.53%、4.10%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.7 加样回收率试验 精密吸取同一已知含量的益气补血口服液（批号180110）9份，每份5.0 mL，分别置于50 mL量瓶中，精密加入各对照品储备液适量，使高、中、低浓度对照品加入量与所取供试品中待测定成分量之比控制在 1.5∶1、1∶1 和 0.5∶1［4］，按“2.1.2”项方法制备供试溶液，进样测定，计算回收率，见表3。

表3 加样回收率试验（n＝9）

2.8 样品测定 取3批次益气补血口服液样品，按照“2.1.2”项方法制备供试品溶液，进样测定其含量，见表4。

表4 各成分含量测定结果mg／mL

3 讨论

3.1 检测方法的选择 芍药苷［5］、阿魏酸［5］由于极性较大，中药复方制剂中极性成分往往相对较多，各成分之间的干扰大，完全分离相对较难。笔者曾以乙腈-0.1%磷酸溶液（10∶90）为流动相，色谱柱填充剂 Hypersil ODS2（4.6 mm×250 mm，5 μm），流速为1.0 mL／min，结果发现芍药苷在相对保留时间为15.1 min时，仍未能有效分离，再加上阿魏酸、淫羊藿苷、黄芪甲苷等成分，单个样品的分析时间需要约100 min左右，分析时间较长且分离效果不理想、前处理过程较复杂［5］。采用液-质联用，以MRM 方式测定，有效避免其他成分的干扰，专属性更高［6］，可以准确测定样品中芍药苷、阿魏酸、淫羊藿苷、黄芪甲苷的含量。

3.2 芍药苷质谱条件的考察 芍药苷在ESI＋模式下， 可产生 m／z 481.2→463.1，319.2，301.1，197.1，178.9等碎片离子，其中以m／z 301.1的碎片离子丰度较高，前期选择了m／z 481.2→301.1作为离子对进行MRM分析，结果发现在其色谱峰前面出现较大的干扰峰，且分离较为困难，故又以ESI－模式进行参数优化，发现其可产生 m／z 479.1→449.0，357.2，327.0，121.0等碎片离子，其中以m／z 449.0的碎片离子丰度较高，但由于芍药苷在样品中含量相对较高，如果样品稀释倍数过大，其他成分的含量就相对偏低，故最终选择相对丰度较低的离子对m／z 479.1→357.2为其定量离子对。

3.3 阿魏酸质谱条件的考察 阿魏酸在ESI＋模式下，可产生 m／z 195.1→176.9等碎片离子，但同样由于其含量相对较高，稀释倍数小时，其色谱峰为平头峰，故最终选择在ESI－模式下检测，以m／z 194.0→150.1为其定量离子对。

3.4 流动相的选择 由于芍药苷、阿魏酸、淫羊藿苷等在酸性流动相中，峰形较好，故选择在水相中加入少量的甲酸。但黄芪甲苷在水及甲酸溶液中易产生加Na峰（m／z 807.4），故在流动相中加入适量的乙酸铵以抑制其加Na峰的产生。

本实验建立LC-MS／MS法同时测定益气补血口服液中芍药苷、阿魏酸、淫羊藿苷和黄芪甲苷4个成分的含量，该方法简便、快捷，灵敏度高，专属性好，可用于益气补血口服液的质量控制。LC-MS／MS法已逐渐成为中药及中药复方制剂多成分同时测定的较佳方法［7］。