改良抗酸染色法对泌尿系结核的临床诊断价值

袁洋 刘月英 李姗姗 肖璠 陈南山 陈华

（1.西藏山南市乃东区人民医院，西藏 山南 856100；2.武汉市金银潭医院，湖北 武汉 430023）

结核分枝杆菌（M.tuberculosis，MTB）是抗酸杆菌（acid-fast bacilli）的一种类型。结核菌可侵犯全身各组织器官引起结核病。结核病是单一病原菌引起的感染性疾病中死亡率最高的疾病之一，是人类面临的重大公共卫生和社会问题，中国约有50%的人感染过结核分枝杆菌。近年来，由于艾滋病发病率的不断攀升、免疫抑制剂等药物的大范围使用和耐多药菌株增多等原因，结核病的发生率正不断回升［22］，除了常见的肺结核、浆膜腔结核、骨关节结核、消化道结核、淋巴结结核、神经系统结核病之外，原本发病率很低的泌尿系统结核病也呈不断增多趋势。根据报导，现在全世界每年有将近1000万人感染各类结核病，其中泌尿系结核（肾结核、输尿管结核、膀胱结核等）大约占到8-20%.本病早期症状不典型易被误诊为慢性尿路感染，常常被使用氟喹诺酮类抗生素反复抗感染治疗。由于氟喹诺酮类抗生素有杀灭部分结核分枝杆菌的作用，所以前期的治疗往往有一定疗效，但由于反复单用氟喹诺酮类药物短期抗结核治疗，很容易引起耐药结核菌株的集中繁殖导致耐药结核病，故对后期结核病的治疗带来了很大困难［13］。而泌尿系结核病往往被发现时，病变已侵犯到双侧，肾功能已经严重受损，故对人们的身体健康危害极大，严重影响了生活质量，而且治愈率低。因此早期诊断对治疗尤为重要。在众多辅助检查中，病理诊断作为确诊的“黄金标准”占有重要地位，但该方法多通过创伤性检查完成，患者依从性差，诊断的敏感性和阳性率较低，操作耗时费力，故临床上不作为诊断的首选方式。血清学方法比较方便，但是缺乏敏感性和特异性，往往作为辅助诊断。PPD试验检测结果不易区分是否卡介苗接种、MTB潜伏感染及NTM感染。近年来，DNA技术以及其他快速培养技术的发展使得检测结核杆菌的时间大大缩短，但由于价格昂贵，尚未能在临床广泛推广使用。实验室病原学检查具有较高的特异性，且操作简便，患者无痛苦。传统的抗酸染色法（Ziehl–Neelsen染色法）对结核杆菌只有3-5%的检出率，且准确度低。MTB培养是诊断结核病的金标准，阳性率只有25-37%，培养所需时间长，一般在4-8周，虽然现在有先进的BD液体快速培养技术，但是也往往需要2-3周才会观察到结核杆菌生长［18］，这样往往会耽误病情诊断及后续治疗，导致病情进展。近几年，应用玻片离心沉淀仪的改良抗酸染色技术大大提高了结核性脑膜炎的诊断效率，其原理为首先应用玻片离心沉淀仪浓缩脑脊液中的细胞和分枝杆菌，然后进行固定细胞和破坏细胞膜蛋白，再行抗酸染色。由于其浓缩原理较离心沉淀法好，避免了菌的浮力和转移损失的问题，加之收集的菌沉淀面积小，染色后可以同时观察细胞内外的分枝杆菌，所以阳性率较离心涂片法提高了将近80%［3］.因此，我们推测改良染色法亦可应用于诊断泌尿系结核患者，该检验方法有可能在泌尿系结核的早期诊断中发挥重要作用。本研究旨在探讨建立泌尿系结核的尿沉渣改良抗酸染色法，并进一步明确其临床应用价值。现将传统的抗酸菌涂片染色、改良罗氏培养及改良抗酸染色法三种检测方法本别应用到泌尿系结核病例的诊断中，分析比较诊断结果，以评估各种方法对诊断泌尿系结核病的应用价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象

以2014年5月至2017年11月期间，在武汉市金银潭医院诊断泌尿系结核病的病人为研究对象，84例入组病例均符合全国结核病分类诊断标准，且抗结核治疗有效，并经随访确诊［1］。全部患者24小时尿沉渣均为首次采集，其中一侧肾结核、输尿管结核病变58例，男性52例，女性6例，患者年龄19-85岁，平均年龄48.15±22.73岁；双侧病变26例，男性10例，女性16例，患者年龄18-80岁，平均年龄47.11±18.59岁。合并其他系统结核病（如脊柱结核、髋关节结核、肠结核、阴囊结核、结核性胸膜炎、结核性腹膜炎、颈淋巴结结核、神经系统结核、肺结核等)50例，约占59.5%.采集时未经抗结核治疗患者48例，已进行抗结核治疗患者36例：其中治疗1-30天者20例，治疗＞30天者16例（其中2例耐药、4例因过敏等严重药物不良副反应未能完成抗结核疗程）。

1.2 方法

每例尿沉渣标本同时送检传统的抗酸菌涂片染色、改良罗氏培养及改良抗酸染色法。

传统抗酸菌涂片染色法：留取24小时尿液，静置，倾去上清液，留取沉淀，通过离心、涂片、固定、石碳酸复红染液染色、冲洗、美蓝染色、冲洗、沥干、干燥等程序，再使用10×100倍镜检。

改良罗氏培养法：指导患者连续留取三天尿液标本，每天取24小时尿液。静置，倾去上清液，留存沉淀部分20-30毫升，均保存在2-8摄氏度的冰箱中。混合三天的尿液进行培养检测。通过离心、在培养基上接种、在培养箱中孵育的流程进行培养操作［16］。定时判读有无菌落生长。若培养基的斜面上发现菌落出现，则选取菌落做涂片完成抗酸染色的检查。

改良抗酸染色法：前期用3-氨丙基-3-乙氣基甲硅烷工作溶液处理载玻片，晾干备用。嘱患者留取全天24小时的尿液，静置，丢弃上清液，只留下尿液沉淀部分。用粟氏FMU细胞涂片沉淀器装盛0.5毫升尿液沉渣，以500-700转/分钟的速度将标本离心3-5分钟后尿液的有形成分沉积在玻片上，再以4%多聚甲醛溶液将玻片固定15分钟，通过水洗并晾干。接下来使用0.3%Trition-100溶液将玻片浸泡15分钟，再使用0.1摩尔/升磷酸盐缓冲液将玻片冲洗3次并晾干［2］。使用0.3%TritonX-100石碳酸复红溶液染色玻片5分钟，再水洗。使用3%盐酸乙醇脱色1分钟，水洗、晾干。最后使用碱性亚甲蓝复染5分钟后再水洗。自然干燥后，使用10×100倍镜检［5］。

1.3 结果

以国际公认的国家结核病公职规划(RN-TCP)指南为标准，统计检测结果，改良抗酸染色法和传统的Ziehl-Neelsen染色法所检测到的抗酸杆菌均呈现为红色［8］。在100个显微镜视野内可见10-100条抗酸杆菌即为抗酸染色（+），若检测值低于以上标准即为抗酸染色阴性。

1.4 统计学方法

使用通用的SPSS17.0统计软件作数据归纳。使用均数±标准差（)来表示计量资料。通过McNemar x2检验，分别比较Ziehl-Neelsen染色法、培养法和改良染色法各自对抗酸杆菌的检出率；通过x2检验法，比较改良法在已治疗者和未治疗患者中的抗酸杆菌阳性的检出率。差异有统计学意义的标准为P＜0.05。

表1 84例患者尿液检查改良法与传统法抗酸杆菌检测结果（n）

表2 84例患者尿液检查改良法与培养法抗酸杆菌检测结果（n）

2 结果

84例泌尿系结核病患者尿液改良法和传统法、培养法抗酸杆菌检出率分别为57.14%（48/84）和4.76%（4/84）和26.19%（22/84），三者比较之差异有统计学意义（表1，表2）。

48例未治疗患者尿液检查改良法和传统法、培养法的抗酸杆菌检出率分别为62.5%（30/48）和4.16%（2/48）和37.5%（18/48），三者比较之差异有统计学意义（表 3、表4）。

表3 48例未治疗患者的尿液Ziehl-Neelsen染色法与改良法抗酸杆菌检测结果（n）

表4 48例未治疗患者尿液改良法和培养法抗酸杆菌检测结果（n）

随着治疗时间的延长，尿沉渣内分支杆菌数量不断减少，各种方法对抗酸杆菌的检出数量均显著降低。但在对治疗时间大于一个月的16例病案的检测中，改良法仍然检测出6例（+），其中一位患者在药物治疗4个半月后尿沉渣中仍能通过改良法检测出抗酸杆菌。

未治疗和已治疗的患者尿液改良法的抗酸杆菌检出率分别为62.5%（30/48）和50%（18/36），两者比较差异有统计学意义（P＜0.05，表5）。

表5 未治疗患者与已治疗患者尿沉渣改良法的抗酸杆菌检测结果（p＜0.05）

3 讨论

目前在泌尿结核（肾结核、输尿管结核、膀胱结核等）的诊断过程当中，医学影像学和病原微生物学检查被最广泛的接受和使用。在泌尿系结核疾病的早期，超声多普勒的诊断意义极其有限，往往多普勒检查只用于疾病的初筛和复查［4］。虽然CT或IVU的典型征象对中晚期泌尿系结核具有确诊的价值［5］，但此时疾病的治疗难度大、治疗费用昂贵、患者预后也差。由此可见，对泌尿系结核病的早期临床诊断而言，微生物病原学检查价值更大。

传统Ziehl-Neelsen染色法，其优点在于操作简便，对设备的要求很低，检测时间短，仅需1-2个小时就可以出报告，而且病人经济负担轻，可广泛用于结核病的筛查；短板在于其准确率跟检验操作者的熟练程度相关，而且检验灵敏度相对低，阳性率通常在25%-28%［1］.而且必须在每毫升标本内存在 5000-10000条菌的前提下才可检测出阳性报告。

由于有检测灵敏度高、特异性强，相对被污染的几率小、实验步骤简便，对仪器设备水平要求低等优点，而且还可以进一步进行药敏实验和菌型鉴定来指导临床治疗，改良罗氏培养法一直被看做临床上结核病诊断的"黄金标准”［6］。但此法的缺点也显而易见：实验时间长，可能延误诊断和治疗，而且于前期的经验性抗结核治疗可能引起继发性耐药导致检验结果不能精准、适时的运用于临床。

近年来新兴的荧光定量PCR、结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT)和GeneExpert等检测技术，虽然灵敏度高、特异性强、检测时间短［15］，但对实验室环境要求极高［19］、诊断成本较高，病人经济负担较重，故目前尚未能在临床广泛开展。

综上所述，抗酸染色法虽然存在着阳性率低和其他一些劣势，但目前仍是肾结核、输尿管结核、膀胱结核等疾病确诊的主要方法［2］。

离心对传统的染色和培养法都是必不可少的重要步骤，离心的主要作用是浓集抗酸杆菌，但离心的过程可能进一步丢失掉本身数量就有限的分枝杆菌。针对传统方法离心过程中可能丢失上浮的抗酸杆菌、分枝杆菌在离心过程中由于紧贴在管壁而没能集中到底部导致进一步丢失、在染色水洗的过程导致分支杆菌丢失等问题［7］，改良法使用了Cytospin玻片离心沉淀仪，通过合理使用滤纸等方式，有效地克服了以上弊端，最终使尿液有形成分的沉淀面积（直径6毫米）远小于传统方法，达到了浓缩集菌的目的［11］。

针对结核杆菌的细胞壁富含脂质，改良法所使用的TritonX-100是一种非离子型表面活性剂［14］，它可以溶解分枝杆菌菌细胞壁所富含的脂质，以此增加细菌细胞壁对染色剂的通透程度［9］，从而增加胞内抗酸杆菌的检出率，提高染色的阳性率。

本研究显示，对于肾结核、输尿管结核、膀胱结核等患者，改良法对尿液的抗酸杆菌检出率显著显高于Ziehl-Neelsen染色法（P均=0.000），这与在结核性脑膜炎患者脑脊液中所作出的研究结论相符［7］。特别对于尚未开始抗结核治疗的病例，改良法针对尿液中抗酸杆菌检出率达到62.5%，而Ziehl-Neelsen染色法仅为4.16%，其阳性检出率有质的提升［10］。这对于早期发现、诊断和治疗病人意义重大。

经过有效抗结核治疗的患者，其抗酸杆菌的检出率呈不断下降趋势。本研究中，对于2例耐药和4例因严重药物副反应未能完成抗结核治疗的病例，改良法亦从患者后期的尿液中检出了抗酸杆菌。提示改良抗酸染色法不仅可用于早期诊断，而且在及时反映患者病情演变、监测疗效等方面，也具有传统检测方法所不具备的治疗指导意义。

传统的Ziehl-Neelsen染色法在操作过程中将细胞结构完全破坏，故无法检测出细胞内的分枝杆菌［12］。但在本研究中，通过改良法有30例患者检出了胞内的抗酸杆菌。改良法使用特殊处理的载玻片以及粟氏FMU细胞涂片沉淀器，能够最大程度的保留尿沉渣标本中细胞的原始结构，再通过TritonX-100使胞内菌体更充分的着色来检出胞内分支杆菌［21］。往往因为菌体形态的不典型，细胞外的抗酸杆菌很容易与一般杂质相混淆，改良法对胞内菌的检出可以成功避开这个矛盾，检测特异性更高。

综上所述，改良法能提升抗酸杆菌检出率，可以同时检测出细胞外和细胞内的抗酸杆菌，而且对抗结核治疗过程中患者标本的检出阳性率也高于传统Ziehl-Neelsen染色法。因此，通过改良法检测尿沉渣中的抗酸杆菌，对于泌尿系结核患者的早期诊断和治疗，具有很高的临床应用价值，且该方法操作简单、实验时间短，检验成本低，尿液标本容易获取，患者没有二次感染的风险，适合在广大的基层医院广泛开展。

虽然改良法在泌尿结核病的诊断上较传统方法有很大改进，但由于仍可能存在假阴性或假阳性报告［20］，其检测的特异性和灵敏度需要在临床中进一步验证并指导方法改进。由于改良抗酸染色法只能检出抗酸杆菌，不能分辨是否为结核分枝杆菌，也不能提供检出菌是否致病状态或潜伏感染状态的依据［17］，故临床上还需要进一步分析判断以决定最终治疗。因此，完整的泌尿系结核诊断仍然需要将病史特点、临床表现、实验室检测、影像学资料、病理学诊断、诊断性治疗的疗效等多方面因素相结合进行综合分析研判，才能精准提升泌尿系结核病的及时诊断率，为早期、规则的抗结核治疗赢得宝贵时机。