松油烯-4-醇对蚕豆蚜虫的毒力及对其Na+,K+-ATP酶活力的影响*

姚陈霞， 刘亚飞， 黄金龙， 阮永明

(1.浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华 321004；2.云南森美达生物科技有限公司,云南 楚雄 675100)

松油烯-4-醇(Terpinen-4-ol)广泛存在于多种植物精油中，且是大多数植物精油的主要成分.目前发现水蒸气提取物中含有松油烯-4-醇成分的植物已有80余种，其中从柏科、菊科、姜科和唇形科等植物提取的精油中，松油烯-4-醇所占比例非常高.Kaul等[1]发现从菊蒿(Tanacetumlongifolium)根部提取的黄色精油中主要成分为松油烯-4-醇，占总成分的25.8%，Bordoloi等[2]通过水蒸气蒸馏法使卡萨蒙纳姜(Zingibercassumunar)根中所含成分分离出来，发现其松油烯-4-醇的含量为50.5%.

国内外关于松油烯-4-醇对卫生害虫和农业害虫的作用研究有很多.如 Cowles 等[3]发现松油烯-4-醇对葱蝇(Deliaantigua)等昆虫有忌避作用，而且对不同种类的昆虫具有明显的触杀和熏蒸毒力.Tighe等[4]发现松油烯-4-醇对蠕形螨(DemodexfolliculorumandD.brevis)生物活性具有强烈的抑制作用，是导致其死亡的主要原因.陈根强等[5]发现松油烯-4-醇对不同昆虫如家蝇(Muscadomestica)、玉米象(Sitophiluszeamais)、粘虫(Mythimnaseparata)、小菜蛾(Plutellaxylostella)和赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)的熏蒸毒力有所差别，对鳞翅目昆虫的熏蒸毒力更为明显.松油烯-4-醇作用于供试昆虫后，试虫一般都依次表现为兴奋、痉挛、麻痹和死亡4个阶段.一般认为，比较快的中毒死亡大部分都是由于药物直接作用于神经系统.松油烯-4-醇作用于供试昆虫后，供试昆虫表现出的中毒症状与六六六、环戊二烯类等药剂作用于昆虫后的中毒症状非常相似，都具有典型的神经毒剂特征[6].

陈根强等[7]观察了松油烯-4-醇对粘虫幼虫体壁结构的影响，发现松油烯-4-醇熏蒸处理会导致粘虫体表的蜡质层颗粒溶解，并对气门和体壁有不同程度的破坏.马志卿等[8-10]测定了松油烯-4-醇对粘虫体内几种酶的影响，研究表明，松油烯-4-醇可以激活血淋巴酯酶、超氧化物歧化酶和磷酸酶，而抑制了Na+,K+-ATP酶、谷胱甘肽S-转移酶和过氧化物酶的活性；马志卿等[11-12]发现松油烯-4-醇主要是通过抑制昆虫体内Na+,K+-ATP酶的活性使昆虫中毒乃至死亡，供试昆虫体内Na+,K+-ATP酶活性被抑制后，导致Na+,K+和Ca2+等离子的运输出现混乱，并释放一些神经递质使机体出现中毒症状.陈根强[13]发现松油烯-4-醇主要是通过干扰Na+通道的正常开闭来抑制Na+,K+-ATP酶活性，从而使神经传导紊乱然后发生一系列中毒反应，抑制的同时还伴有试虫大量失水并引起血淋巴理化性质的改变.为进一步探索松油烯-4-醇的杀虫机理、研发新型生物农药做好基础研究，本实验测定了松油烯-4-醇对蚜虫的熏蒸和触杀毒力，并进一步测定了其对蚜虫Na+,K+-ATP酶活性的影响.

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 主要试剂

松油烯-4-醇(纯度99%，由云南森美达生物科技有限公司提供)；ATP酶测试盒(购自南京建成生物工程研究所)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(购自碧云天生物技术公司).

1.1.2 供试昆虫

蚕豆蚜(Aphiscraccivora)：室内长期以蚕豆苗饲养(温度：(25±1) ℃；湿度：70%～80%；光照/黑暗：16 h/8 h)的敏感种群，挑选个体大小发育一致、活性良好的无翅成蚜供试.

1.2 试验方法

1.2.1 熏蒸毒力测定

松油烯-4-醇对蚕豆蚜虫的熏蒸毒力测定用锥形瓶熏蒸法[14].把大小一致的无翅成蚜接入锥形瓶(V=300 mL)中，瓶塞中央插入大头针，把长为4 cm、宽为2 cm的滤纸条固定在大头针顶端，悬挂在瓶口上.用丙酮作为溶剂把松油烯-4-醇稀释至10，20，40和80倍，用移液器分别向滤纸条上滴加一定量不同稀释倍数的试剂，对照组滴加等量丙酮，滴加之后快速盖上瓶塞.每种试剂分别处理50头蚜虫并重复3次.根据锥形瓶体积和滴加试剂的体积可算出不同稀释倍数下松油烯-4-醇的浓度.只滴加松油烯-4-醇时，所含松油烯-4-醇的浓度为69.975 0 mg/L；将松油烯-4-醇稀释至10，20，40和80倍时，所含松油烯-4-醇的浓度为6.997 5，3.498 7，1.749 3和0.874 6 mg/L.将锥形瓶置于养虫室，8 h后检查死亡的蚜虫数，统计出死亡率及校正死亡率，然后用概率值分析法和Excel表格求得毒力回归方程，并用SPSS统计分析软件对方程进行卡方检验，求出8 h的致死中量(LC50)和95%置信区间[15].

1.2.2 触杀毒力测定

用丙酮作为溶剂把松油烯-4-醇稀释至10，20，40和80倍，用移液器点滴0.5 μL到蚜虫的前胸背板，每种试剂分别处理50头蚜虫并重复3次.对照组点滴等量的丙酮[16].根据丙酮和松油烯-4-醇的密度可求出不同稀释倍数下松油烯-4-醇的施药量.只滴加松油烯-4-醇时，其每头施药量为466.500 0 μg；将松油烯-4-醇稀释至10，20，40和80倍时，每头松油烯-4-醇的施药量为46.650 0，23.325 0，11.662 5和5.831 2 μg.8 h后检查死亡的蚜虫数，统计出死亡率及校正死亡率，然后用概率值分析法和Excel表格求得毒力回归方程，并用SPSS统计分析软件对方程进行卡方检验，求出8 h的致死中量(LD50)和95%置信区间[15].

1.2.3 酶活力测定方法

将经过熏蒸和触杀处理的无翅成蚜分别进行Na+,K+-ATP酶活性测定.将经过试剂处理的无翅成蚜，加入2 ml预冷的0.01 mol/L Tris-Hcl(pH 7.0)，冰浴研磨，然后高速离心(10 000 r/min)15 min，取上清液进行蛋白浓度测定和 Na+,K+-ATP酶活性测定[17].

Na+,K+-ATP活性测定参照Na+,K+-ATP酶试剂盒说明书进行.蛋白含量的测定参照BCA测试盒说明书进行.

2 结果与分析

2.1 熏蒸毒力测定结果

松油烯-4-醇对蚜虫的熏蒸毒力结果见表1.松油烯-4-醇对蚜虫有显著的熏杀作用，且随着浓度的增加，熏杀效果越强.根据表1中的数据计算出松油烯-4-醇对蚜虫的毒力回归线，结果见表2.

表1 松油烯-4-醇对蚜虫的熏蒸毒力测定结果(8 h)

表2 松油烯-4-醇对蚜虫的熏蒸毒力回归线(8 h)

2.2 触杀毒力测定结果

松油烯-4-醇对蚜虫的触杀毒力结果见表3.松油烯-4-醇对蚜虫有显著的触杀作用，且随着浓度的增加，触杀效果越强.根据表3中数据计算得出松油烯-4-醇对蚜虫的触杀毒力回归线，结果见表4.

表3 松油烯-4-醇对蚜虫的触杀毒力测定结果(8 h)

表4 松油烯-4-醇对蚜虫的触杀毒力回归线(8 h)

2.3 Na+,K+-ATP酶活性测定结果

2.3.1 熏蒸处理后，松油烯-4-醇对蚜虫Na+,K+-ATP酶活性的影响

熏蒸处理后，松油烯-4-醇对蚜虫Na+,K+-ATP酶活性的影响见表5.测定结果表明，经过熏蒸处理后，松油烯-4-醇对蚜虫Na+,K+-ATP酶活性具有显著的抑制作用，且随着松油烯-4-醇浓度的增加，抑制作用越强.

表5 松油烯-4-醇熏蒸对蚜虫Na+,K+-ATP酶活性的影响

注：标准曲线方程：y=0.019 6x+0.088 8,R2=0.999 2.

2.3.2 触杀处理后，松油烯-4-醇对蚜虫Na+,K+-ATP酶活性的影响

触杀处理后，松油烯-4-醇对蚜虫Na+,K+-ATP酶的活性的影响见表6.测定结果表明，经过触杀处理后，松油烯-4-醇对蚜虫Na+,K+-ATP酶活性具有显著的抑制作用，且随着松油烯-4-醇浓度的增加，抑制作用越强.从表5和表6可知，松油烯-4-醇稀释后，触杀对蚜虫Na+,K+-ATP酶活性的抑制均高于熏蒸；而松油烯-4-醇直接作用于蚜虫时，触杀和熏蒸对Na+,K+-ATP酶活性的抑制作用几乎相同.

表6 松油烯-4-醇触杀对蚜虫Na+,K+-ATP酶活性的影响

注：标准曲线方程：y=0.023 6x+0.091 4,R2=0.995 9.

3 讨论

神经毒剂杀虫剂一般作用于害虫的神经系统，影响害虫神经的传导，来达到杀死害虫的目的.比如双对氯苯基三氯乙烷和除虫菊酯等阻遏昆虫轴突的传导；六氯环己烷和六氯-环氧八氢-二甲撑萘等阻遏神经递质乙酰胆碱的传导.这几种杀虫剂都是通过阻碍害虫的神经传导，使害虫出现一系列中毒症状，包括兴奋、抽搐痉挛、运动失调和麻痹等，直至死亡[18-19].陈根强等[5]研究发现,松油烯-4-醇作用于家蝇成虫后也会表现出上述中毒症状.而本研究观察到松油烯-4-醇作用于蚜虫后也会出现一系列神经中毒症状，其症状与松油烯-4-醇对家蝇和滴滴涕、拟除虫菊酯类等神经毒剂处理的昆虫相似[6].

ATP酶可以调节细胞膜内外两侧离子的浓度使其平衡，来保持细胞的静息电位.Na+,K+-ATP酶具有维持细胞膜内外Na+和K+浓度平衡的作用，其活性发生改变后，就会显著影响细胞的稳定，使细胞的代谢发生错乱.研究表明，拟除虫菊酯类杀虫剂主要是通过影响昆虫神经系统中Na+,K+-ATP酶的活性从而导致昆虫死亡[20-21].Na+,K+-ATP酶活性被抑制后，试虫机体很快就会出现一系列反应，随后就会出现神经中毒的症状[22].本研究发现，松油烯-4-醇对蚕豆蚜虫熏蒸和触杀处理后，都会显著抑制Na+,K+-ATP酶的活性，且触杀的抑制效果大于熏蒸的抑制效果.结合马志卿等[23-24]的研究结果：松油烯-4-醇对粘虫和家蝇的Na+,K+-ATP酶的活性也都具有良好的抑制作用，所以，松油烯-4-醇的主要作用靶标极有可能是Na+,K+-ATP酶.目前其杀虫机理还不清楚，推测可能与拟除虫菊酯类杀虫剂相似，还需进一步研究.

迟家家等[25]测定了吡虫啉、高效氯氰菊酯、阿维菌素、毒死蜱和吡蚜酮等几种杀虫剂对豆蚜的毒力大小(24 h)，其LC50值分别为0.247,0.262,0.381,0.386,35.710 mg/L.本实验测得松油烯-4-醇对蚕豆蚜虫的LC50和LD50值分别为4.834 2 mg/L,10.282 7 μg/aphid.所以，松油烯-4-醇对蚜虫具有很强的熏蒸和触杀毒力.目前化学农药的泛滥使用及其带来的环境问题，使人们意识到寻找和研发新型生物农药的重要性.新农药研发主要是通过从已知的天然产物中提取有杀虫活性的成分，松油烯-4-醇广泛存在于多种植物精油中，且该化合物对人、畜及环境都安全[26-27]，可以尝试利用该化合物开发合成出更安全高效且对环境无污染的新型植物源农药.