三个品系蛋鸭β2m基因的克隆及多态性研究

张琳 于森 白俊平�┝侄�梅 杨少华 黄艳艳 吴家强 蒋万春

摘要：为明确鸭主要组织相容性复合体Ⅰ（major histocompatibility complex， MHCⅠ）β微球蛋白（β2-microglobulin， β2m）分子的多態性和特征，推进相关免疫研究，本试验对我国3个地方品系蛋鸭的多条β2m基因进行克隆，序列经特征分析、同源比对和遗传进化分析后，进行了高变异位点的计算，并将重要变异位点在3D结构上进行了定位。结果表明，鸭β2m基因高度保守，仅个别碱基发生突变，序列中半胱氨酸、免疫球蛋白超基因家族的特征基序“YxCxVxH”和与重链相互作用的位点均保守性存在；筛选的47条β2m氨基酸序列同源性为95%～100%，完全一致序列普遍存在；鸭β2m氨基酸序列与鸡同源性最高，与鱼类和两栖类最低，结果与遗传进化分析相一致；成熟肽中高变异位点和与重链相互作用的变异位点多位于β折叠上，但不会对β2m的功能产生影响。综合来看，鸭β2m基因保守性高，仅存在一种类型，与MHCⅠ重链的作用方式也相对固定。本试验结果有助于深入理解鸭β2m的分子特性，推动MHCⅠ相关免疫研究的开展。

关键词：鸭；主要组织相容性复合体（MHCⅠ）；β微球蛋白（β2m）；多态性

中图分类号：S834：Q78 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2018）08-0142-06

Cloning and Molecular Polymorphism of β2m

Gene from Three Laying Duck Lines

Zhang Lin1， Yu Sen1*， Bai Junping1，2， Lin Dongmei2， Yang Shaohua1，

Huang Yanyan1， Wu Jiaqiang1， Jiang Wanchun2

（1. Institute of Animal Science and Veterinary Medicine， Shandong Academy of Agricultural Sciences/

Shandong Key Laboratory of Animal Disease Control and Breeding， Jinan 250100， China；

2. College of Life Sciences and Food Engineering， Hebei University of Engineering， Handan 056021， China）

Abstract In order to clarify the polymorphism and characteristics of β2-microglobulin （β2m） gene， a major histocompatibility complexⅠ （MHCⅠ） in ducks and promote related immune research， representative β2m genes from three local laying ducks in China were cloned. Subsequently， their sequences were analyzed through multiple sequence alignment， homologous comparison and phylogenetic tree method. The highly variable residue sites （HVSs） were estimated by Wu-kabat variability index， as well as key variable sites， then their location on reported crystal structure model were studied. As a result， duck β2m genes were highly conserved with little mutant bases. The two cysteines，the Ig feature motif YxCxVxH and the interactive residues between heavy and light chains were all highly conserved. The amino acid homology among 47 screened duck β2m sequences ranged from 95%～100% and identical sequences were ubiquitous. Duck β2m shared the highest homology with chicken， and the lowest with fish and amphibian， which was consistent with the results of genetic evolution analysis. Most of HVSs and mutant residues interacted with heavy chain of MHCⅠ molecule were mainly located on β-strand， but they would not affect the structure of β2m and the interaction with heavy chains. These results showed that there was only one type β2m in ducks with high conservatism and the interaction with heavy chain were stationary. The results would give us a better understanding for duck β2m and promote further immune research of MHCⅠ.

Keywords Laying duck； Major histocompatibility complex （MHC Ⅰ）； β2-microglobulin （β2m）； Polymorphism

主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex， MHC）是编码与免疫应答直接相关且具有高度多态性的基因群，作为肽受体服务于免疫系统[1]。其中MHCⅠ分子在抵抗病原感染的免疫反应中起关键作用[2]。MHCⅠ分子分为重链和轻链两部分，重链由MHCⅠ类基因编码，而轻链则由位于另一条染色体上的β2m基因编码。β2m以非共价的方式与重链结合并定位于有核细胞膜上，对于维持MHCⅠ类分子的正确折叠和构型的稳定不可或缺[3]。同时β2m对于MHCⅠ-肽复合体的组装起关键作用，也只有在其存在的情况下，MHCⅠ才能与抗原肽结合形成三分子复合物，并被CD8+T细胞上的T细胞抗原受体（TCR）特异性识别，从而诱导细胞免疫反应的发生[4]。相对于MHCⅠ重链基因由多个基因座的不同等位基因表达而形成高度多态性，β2m基因往往不具备多态性或者只呈现出有限的多态性：人的β2m仅由一个基因编码，不具有多态性；哺乳动物的β2m也是由单个基因编码，但存在多个等位基因，表现出有限的多态性[5-7]。然而在低等脊椎动物硬骨鱼中的情况则不同，虹鳟、鲟鱼、斑马鱼和草鱼等多由不同基因座上的等位基因表达两种类型的β2m分子，功能上也可能存在差异[8-10]。禽类的进化地位处于鱼类与哺乳动物之间，鸡的β2m表现出一定的多态性，依据同源性可划分为两类，同时可能存在新的等位基因[11]。作为亲缘关系较近的鸭，其β2m是否也存在不同的等位基因，基因多态性的程度如何均未见报道。本研究拟克隆3个品系鸭的β2m基因并进行多态性分析，然后利用同源模建对变异位点在三维结构上进行定位，以明确鸭β2m的多态性及其对结构和功能的影响，以期为β2m免疫作用机理的进一步研究提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

从5个鸭场购买了我国3个蛋鸭品种的鸭38只，其中24只绍兴鸭来自3个不同地区的鸭场，每个鸭场8只，分别命名为SX、SB、SD；金定鸭（JD）和微山麻鸭（WS）各7只，同一品种来自同一鸭场。所有鸭饲养至12周龄时剖取脾脏，用于总RNA的提取。

RNAiso Plus、Ex Taq、pMD18T克隆載体购自宝生物工程（大连）有限公司；DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒等购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 RNA提取、cDNA 合成和β2m基因的PCR扩增 剖取鸭新鲜脾脏，Trizol法提取总RNA，并利用随机引物反转录成第一链cDNA。设计鸭β2m基因特异性引物P1（5′-ATGGCCAAGGCGGCGATCGTGG-3′）、P2（5′-TTAGAAGTCTGGCTCCCATCTGAAGGACTG-3′），进行编码区序列的PCR扩增。反应体系为：10×Ex Taq buffer 5 μL，P1/ P2（10 μmol/L ）各1 μL，cDNA模板 0.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，Ex Taq酶 0.5 μL，ddH2O补足50 μL。反应条件为：98℃预变性5 min；94℃变性30 s，68℃退火30 s，72℃延伸30 s，32个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，回收目的序列，连入pMD18T载体，转化大肠杆菌DH5α。每个样品条带挑取3个单克隆菌落进行鉴定，阳性质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。对于阳性序列，均进行两次平行的PCR验证，方作为有效序列。

1.2.2 序列分析和进化树的构建 利用DNAMAN、GENETYX和Jalview软件进行序列分析，采用ClustalW和Jalview软件进行序列比对。在对β2m胞外区核苷酸序列进行比对的基础上，利用MEGA6构建系统进化树[12]。

1.2.3 变异位点在鸭β2m结构上的定位 在PVS服务器上（http：//imed.med. ucm.es/ PVS/）对β2m成熟区氨基酸变异频率进行计算，利用Wu-Kabat计算方法[13]，将指数≥4.0的位点认定为高变异位点（HVS），同时将其与MHCⅠ重链相作用的变异位点在3D结构上进行定位，相关操作使用PyMOL软件完成。模建所用结构为Anpl-UAA*01 （PDB： 5GJX）。

2 结果与分析

2.1 β2m基因扩增与基本特征分析

从38只试验鸭中共克隆得到典型β2m基因93条，其中SX中分离15条、SB 21条、SD 19条、JD 20条、WS 18条。经比对发现，各品系中分离得到的β2m基因核苷酸同源性较高，完全一致的序列普遍存在。将各品系中完全相同的序列仅保留1条后，3品系鸭共得到序列47条（SX 13条、SB 12条、SD 12条、JD 5条、WS 5条）。对47条序列进行分析发现，所有序列编码区长360 bp，编码119个氨基酸，其中5′端18个氨基酸为信号肽，之后101个氨基酸为成熟肽。如图1所示，成熟肽序列较为保守，变异位点少且较为分散；在第27 位和82位为保守的半胱氨酸（C），可形成一对二硫键，连接两个β片层。在第82 位半胱氨酸附近存在保守的“YTCRVDH”序列，符合免疫球蛋白超基因家族的特征基序“YxCxVxH”（x代表任一氨基酸）[11]；在与MHCⅠ分子重链相互作用的12个氨基酸中，除第2位（P2）和第10位（P10）谷氨酰胺（glutanine， Q）发生变异外，其余位点均高度保守。

2.2 序列同源性分析

对获得的47条β2m成熟区氨基酸序列进行同源性分析发现，同源性在95%～100%之间。按照品系来看，绍兴鸭的同源性为96%～100%，金定鸭为96%～100%，微山麻鸭为98%～100%，序列保守性均较高。虽然各品系中核苷酸完全相同的β2m序列只选择了一条，但推导的成熟区氨基酸序列相一致的比例仍然很高，有18条，占序列总数的38.30%，其中金定鸭中有2条（占比40.00%），微山麻鸭为3条（占比60.00%），绍兴鸭中SX、SB、SD分别为4条（占比30.77%）、6条（占比50.00%）和3条（占比25.00%）。以上结果表明，鸭的β2m序列高度保守，成熟肽一致的序列在不同品系中普遍存在；氨基酸的突变为随机的点突变，替换率在不同群体中不一致。

将鸭β2m成熟肽与人（M30682）、鼠（X01838）、猪（FJ944026）、羊（EF489536）、牛（NM_173893）、猴（AY445834）、鸡（M84767）、鱼（AB128864）和蛙（AF217962）的相应序列进行同源性比对，发现鸭与鸡的同源性最高，为60.4%；与鱼类、两栖类蛙的同源性最低，分别为44.9%和32.0%；而与人类、哺乳动物的同源性介于47.5%～51.0%之间。

2.3 进化树的构建

对同源性低于98.0%的鸭β2m成熟肽序列和人、鸡、鱼、蛙和其他哺乳动物的序列构建了系统进化树。图2所示，鸡与鸭的亲缘关系最近，处于同一分支，应为同一祖先进化而来，鱼类和两栖类动物与之遗传距离最远。

2.4 变异位点在3D结构上的定位

如图3所示，β2m分子共存在2个HVS，分别位于P39和P64。随后将高变异位点和与MHCⅠ重链相互作用的变异位点在鸭β2m的3D结构上进行了定位（图4），发现2个HVS（红色标注）虽位于两个β片层的折叠上，但并不是与重链相互作用的关键位点。而与重链作用的变异位点P2（Q→L）位于loop上，P10（Q→E）则位于A折叠上。

3 讨论与结论

本研究中共获得93条有效的β2m基因序列，核苷酸序列比对后发现有近50%的序列完全一致，而剩余47条成熟肽氨基酸序列的同源性为95%～100%，且同源性为100%的序列共有18条，变异以点突变为主且较为随机，表明鸭β2m基因高度保守。对氨基酸序列的进一步分析发现，鸭β2m具有典型的免疫球蛋白超基因家族的特征基序“YxCxVxH”，形成二硫键的半胱氨酸保守存在，与重链相互作用的12个氨基酸也高度保守（序列发生P2和P10的氨基酸替换）。所以，鸭β2m与高等脊椎动物的β2m基因一样十分保守，不存在不同类型。虽然分离得到的β2m基因数量有限，但至少能够反映鸭β2m存在不同类型的概率极低。

动物不同品系往往表达不同的基因类型。早先的研究表明，鸡β2m是由单个基因编码的单一蛋白，高度保守，不存在多态性[14，15]。但2005年，Yan等[11]在我国3个地方品系鸡中发现了新的β2m等位基因。本研究中，我们同时选择了3个地方品系的鸭（其中包括不同环境饲养的3种绍兴鸭）进行β2m的扩增，但并未发现新的基因群或等位基因，且3个品种中均分离到完全一致的序列，可见鸭品系的不同对β2m基因的影响不大，即使生存环境压力使MHCⅠ分子的重链进化产生高度多态特性（结果另文发表）。

虽然鸭β2m基因高度保守，相同基因的覆盖率也很高，但对其氨基酸进行变异位点分析仍发现两个高变异位点。P39和P64位于β折叠股上，但两位点并不参与与重链的相互作用，对于β2m功能的影响并不明显。此外，在与重链相互作用的12个位点中，也有2个位点的氨基酸发生了替换。为了明确变异对功能的影响，我们也对其在3D结构上进行了定位和分析，P2位于loop上，其C端与重链Lys117形成一个氢键，而N端则处于游离状态[16]，所以由Gln突变为Leu不会影响其结构与功能的变化；P10位于β折叠股上，其C端与重链Trp240、Pro231两氨基酸各形成一个氢键[16]，但Gln和Glu均为芳香族酸性氨基酸，结构组成相似，故突变同样对结构的影响不大。此外，鸭只表达一种MHCⅠ基因，但具有高度的多态性，有利于多肽的结合和对疾病的抵抗[17]。而其分子中与β2m相互作用的位点却相当保守，对应的β2m上12个作用位点也高度一致，这就决定了鸭MHCⅠ重链与轻链之间的作用方式仅有此一种。

将鸭β2m与其他物种β2m 的氨基酸序列进行同源比对发现，鸭与鸡的同源性最高（60.4%），而与鱼类、两栖类蛙的同源性最低（44.9%和32.0%），与人和哺乳动物的同源性居中，这也与进化树所反映的进化关系相吻合，即位于哺乳动物和鱼类之间。从进化角度来说，鸭β2m基因的保守性高，不具有多态性，此特点更接近于哺乳动物；但同时鸭β2m与重链的相互作用面积是目前已知动物中最大的，且相互之间的结合键也是最多的[16]，这也使得MHCⅠ分子在多肽不存在的情况下形成功能复合体，这表明鸭MHCⅠ向着结构更为稳固的方向在进化，此特点又与低等脊椎动物免疫球蛋白超基因家族（IgSF）的特点类似[18]。所以我们推测，鸭β2m很有可能是鱼类β2m向哺乳动物β2m进化的重要过渡分子。

本研究对3个品系鴨中扩增的β2m基因进行了多态性和特征分析，发现鸭β2m仅有一种类型且高度保守，高变异位点和与重链相互作用关键位点的突变不会对其功能产生影响。研究结果明确了鸭β2m的保守性，为后续相关免疫研究的开展提供了基础资料。

参 考 文 献：

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