玉米ZmC3H18基因的序列及表达分析

李文兰 李文才 孙琦 于彦丽 赵勐 李艳娇 孟昭东

摘要：CCCH型锌指蛋白是锌指蛋白超家族的一个亚家族，一般包含1～6个由三个半胱氨酸和一个组氨酸组成的基序，在植物的生长发育和非生物胁迫过程中均发挥重要的调控作用。本研究中，我们对CCCH型锌指蛋白基因ZmC3H18的序列及表达进行了分析。ZmC3H18蛋白包含2个CCCH结构域，系统进化树分析表明ZmC3H18与单子叶植物中同源基因的进化关系更近。ZmC3H18基因在组织器官中呈组成型表达，但是在生殖器官中的表达量高于在营养器官中的表达量。ZmC3H18基因在气生根中的表达模式显示该基因在气生根原基起始过程中表达量最高。此外，顺式作用元件分析显示ZmC3H18基因的启动子区含有响应冷、热和干旱胁迫的顺式作用元件。实时定量PCR分析显示ZmC3H18基因的表达受非生物胁迫（冷、热、盐和干旱）调控。这些表达结果显示ZmC3H18基因在生殖生长和非生物胁迫过程中均发挥重要作用。本试验结果将为玉米ZmC3H18基因的功能研究提供重要信息。

关键词：玉米；ZmC3H18；CCCH结构域；表达分析

中图分类号：S513：Q78 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2018）08-0007-05

Sequence and Expression Analysis of ZmC3H18 Gene in Maize

Li Wenlan， Li Wencai， Sun Qi， Yu Yanli， Zhao Meng， Li Yanjiao， Meng Zhaodong

（Maize Research Institute， Shandong Academy of Agricultural Sciences/National Engineering

Laboratory of Wheat and Maize/Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of

Maize in Northern Yellow-Huai River Plain， Ministry of Agriculture， Jinan 250100， China）

Abstract CCCH type zinc finger proteins that one group of the super zinc finger families are shown to contain 1～6 CCCH-type zinc finger motifs characterized by three cysteines followed by one histidine. The CCCH zinc-finger proteins play important regulatory roles in many developmental processes and abiotic stress responses. In this study， we analyzed the sequence and expression of CCCH type zinc finger protein gene ZmC3H18. The ZmC3H18 gene contained two CCCH motifs， and the phylogenetic analysis showed that ZmC3H18 and three other proteins from monocotyledon were clustered into the same clades. ZmC3H18 was expressed ubiquitously in various organs， but its transcript levels were higher in reproductive organs than in vegetative organs. Moreover， the expression pattern of ZmC3H18 in brace roots indicated that ZmC3H18 expression level in brace root initiation was the highest. In addition， the promoter region of ZmC3H18 contains cis-acting element involved in cold， hot and drought. Real time quantitative PCR analysis showed that the expression pattern of ZmC3H18 was regulated by abiotic stresses （cold， hot， salt and drought）. The expression results suggested that ZmC3H18 played important roles in reproductive development and abiotic stress responses. The findings of the present study would provide important informations to help us understand the function of ZmC3H18 in maize.

Keywords Maize； ZmC3H18； CCCH domain； Expression analysis

鋅指蛋白超家族包含ERF、WRKY、DOF和RING-finger等多个亚家族[1-4]，CCCH型锌指蛋白是其中一个亚家族。CCCH型锌指蛋白一般包含1～6个由三个半胱氨酸和一个组氨酸组成的基序[5，6]，它通过识别并结合RNA发挥生物学功能，而其他类型的锌指蛋白则是通过结合DNA或蛋白发挥作用[7]。CCCH型锌指蛋白在植物的生长发育和非生物胁迫过程中发挥重要的调控作用。例如，拟南芥中的HUA1通过识别结合RNA的方式参与花发育调控[8]，而AtSZF1和AtSZF2则参与盐胁迫响应过程[9]。玉米中的CCCH型锌指蛋白基因家族共有68个成员[10]，其中ZmC3H18基因在气生根早期发育的测序结果中优势表达[11]。本研究对该基因的序列进行了分析，并利用实时定量PCR技术对该基因在各组织器官和非生物胁迫下的表达模式进行了检测。这些结果将为全面了解ZmC3H18基因的生物学功能提供新的信息。

1 材料与方法

1.1 试验材料与生长条件

试验所用玉米材料是B73自交系。材料在光照培养箱中进行长日照培养（16 h光照/8 h黑暗）。冷胁迫处理是将培养两周的幼苗置于4℃培养箱中进行处理；热胁迫处理是将培养两周的幼苗置于40℃培养箱中进行处理；盐胁迫处理是利用250 mmol/L的NaCl对培养两周的幼苗进行处理；干旱胁迫处理是利用15%的PEG6000对培养两周的幼苗进行处理。在处理0、1、3、6、12、24 h和48 h后，收集处理植株的叶片用于实时定量PCR分析。对播种后14 d（V时期）的初级根、第二片叶、整个幼苗植株，播种后25 d（V5时期）的茎秆和播种后34 d（V7时期）的幼嫩雌穗、雄穗分别取材，用于实时定量PCR分析。用于检测气生根中基因表达水平的材料来自V5时期四个连续的节位上。

1.2 基因序列和进化分析

利用SMART软件（http：//smart.embl-heidelberg.de/）对ZmC3H18蛋白氨基酸序列进行分析。将ZmC3H18序列通过NCBI数据库进行Blast比对分析，下载其他物种的同源蛋白序列。利用DNAMAN 7.0软件对该基因和其他物种来源的同源基因进行氨基酸序列分析，并利用最大自然法（ML）构建系统进化树。

1.3 启动子区顺式作用元件分析

利用PlantCare数据库（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/），对ZmC3H18基因起始密码子上游1 500 bp的启动子区序列进行分析。

1.4 RNA提取和实时定量PCR分析

利用Trizol试剂盒提取各样品的总RNA，按照试剂盒说明书完成cDNA的合成和纯化。实时定量PCR分析利用Bio-Rad CFX96实时定量检测系统（Bio-Rad，Hercules，CA，USA），引物序列为ZmC3H18-F：5′-GACAAGAGAAGCGAGGAACC-3′和ZmC3H18-A：5′-TGAGCGAACTGGCACTGG-3′，18S rRNA基因作为内参基因。将胁迫处理0 h的基因表达量设为1，以此为对照，计算其他时间点的基因相对表达量。试验数据通过SPSS 18.0软件进行差异性分析。

2 结果与分析

2.1 ZmC3H18基因序列及进化分析

利用SMART软件对ZmC3H18氨基酸序列进行分析，发现其包含2个CCCH结构域（图1A）。对ZmC3H18和其他13个物种同源基因的氨基酸序列进行比对，发现这14个蛋白均含有2个CCCH结构域（图1B）。这说明CCCH保守结构域在不同物种中同源性极高。

为了解ZmC3H18的进化关系，经过多重比对，构建系统进化树（图2）。结果显示，玉米与同属于单子叶的高粱、粟和水稻聚在同一分支，而与其他双子叶植物的距离较远。

2.2 ZmC3H18基因在玉米气生根发育过程中的表达分析

CCCH型锌指蛋白基因家族的ZmC3H18基因在气生根早期发育的测序结果中优势表达，为此，我们利用实时定量PCR方法对玉米V5时期4个不同节位上处于不同发育时期的气生根（具体的发育形态可参考文献[12]）进行基因表达量检测（图3）。结果显示，ZmC3H18基因在气生根起始时期表达量最高，说明ZmC3H18在气生根原基起始过程中发挥重要作用。

2.3 ZmC3H18基因在各组织中的表达分析

为了进一步了解ZmC3H18基因的表达模式，我们利用实时定量PCR方法检测了ZmC3H18基因在玉米不同组织（根、茎、叶、幼苗、雌穗和雄穗）中的表达水平。如图4所示，在6种组织中均检测到ZmC3H18基因的表达，但生殖组织（雌穗和雄穗）中的表达量明显高于营养组织（根、茎、叶和幼苗）中的表达量。这说明ZmC3H18基因在玉米的生殖发育过程中发挥更重要的作用。

2.4 ZmC3H18基因的顺式作用元件分析

为了更好地了解ZmC3H18基因在逆境胁迫方面的作用，我们对ZmC3H18基因1 500 bp启动子区的顺式作用元件进行了分析。如表1所示，除了转录和光响应相关的必需顺式作用元件，共找到了8个顺式作用元件，包含2个生长发育相关的（GCN4_motif和Skn-1_motif）、3个逆境胁迫相关的（HSE、MBS和LTR）和3个激素响应相关的（ABRE、TGA-element和Motif Ⅱ b）元件。

2.5 ZmC3H18基因在冷、热、盐和干旱胁迫条件下的表达分析

ZmC3H18基因的顺式作用元件包含3个逆境胁迫相关元件。为了进一步研究ZmC3H18基因对逆境胁迫的反应，利用实时定量PCR方法检测了ZmC3H18基因在冷、热、盐及干旱胁迫下的表达变化（图5）。在冷胁迫处理下，ZmC3H18基因的表达量迅速下降，并维持在较低水平；在热胁迫处理下，ZmC3H18基因的表达量先下降后上升，在处理24 h时达到最高峰，之后表达量又开始下降；在盐胁迫处理下，ZmC3H18基因的表达量在处理1 h稍有下降，之后迅速下降，并维持在较低水平；在干旱胁迫处理下，ZmC3H18基因的表达量也迅速下降。这些结果表明，ZmC3H18基因涉及多种逆境胁迫响应。

3 讨论与结论

CCCH型锌指蛋白是锌指超蛋白家族的一个亚家族，在调节植物生长发育以及生物和非生物胁迫方面发挥重要作用。植物中第一个被发现的CCCH型锌指蛋白基因是拟南芥中的PEI1，其参与心胚形成过程[13]。之后研究者们分别对拟南芥[14]、水稻[14]及煙草[15]等多种植物的CCCH型锌指蛋白进行了深入研究。本研究根据气生根早期发育转录组数据[11]，获得了一个在气生根发育早期优势表达的CCCH型锌指蛋白基因ZmC3H18，其具有两个CCCH保守结构域，与其他植物中CCCH型锌指蛋白结构具有较高的相似性。进化关系分析显示ZmC3H18与单子叶植物中的CCCH型锌指蛋白进化关系更近。

CCCH型鋅指蛋白基因参与多个生长发育过程。例如，拟南芥中的HUA1参与花发育[8]，水稻中的OsDOS参与叶片衰老调控[16]，而玉米中的ZmC3H18基因则在气生根原基起始过程中发挥重要作用。在不同组织中的表达分析显示，ZmC3H18基因在生殖器官中的表达量要高于营养器官，这暗示ZmC3H18基因在生殖阶段可能发挥更重要的作用。

CCCH型锌指蛋白基因还参与生物和非生物胁迫。例如，拟南芥中的AtSZF1和AtSZF2参与盐胁迫响应过程[9]。而在冷、热、干旱和盐胁迫下，ZmC3H18基因的表达量均发生不同程度的变化，这暗示ZmC3H18基因参与多种非生物胁迫响应。本研究结果将为系统了解ZmC3H18基因的生物学功能提供新信息。

参 考 文 献：

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