CT引导下肺穿刺活检标本行PCR检测诊断肺结核的临床价值

郭俊红 武春燕 董正伟 吴伟 张莉萍 李辉 黄焰

结核病是严重威胁人类健康的传染性疾病，据2017年世界卫生组织发布的全球结核病年度报告显示，全球每年有超过1000万例新发结核病患者，同时有近170万例患者死于结核病[1]。受到疾病临床分期、抗生素大量使用等多种因素影响，痰涂片抗酸染色、痰结核分枝杆菌培养等的检测阳性率较低，结核病诊断困难。近年来，采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术检测结核分枝杆菌成为诊断结核病的有效手段[2]，而肺细针穿刺细胞学(fine needle aspiration cytology，FNAC)病理检测因其简单快捷、微创安全而被广泛应用于临床取样，可帮助诊断肺部疾病[3-4]。目前两者联合检测的研究较多，但主要集中在对肺外结核的诊断[5-7]，对肺结核诊断效能的研究还较少。本研究采用 CT引导下肺细针穿刺活检标本行TB-PCR检测，以探讨两者联合在肺结核诊断中的应用价值。

材料和方法

一、 研究对象

1.一般资料：回顾性选取2017年1月至2018年3月同济大学附属上海市肺科医院曾疑诊为肺结核、后经病理证实或试验性抗结核药物治疗确诊的111例患者，其中肺结核患者73例(65.8%)，非肺结核患者38例(34.2%；包括结节病3例、肺癌17例、隐球菌感染3例、曲菌感染4例、肺脓肿3例、异物肉芽肿2例，支气管扩张症6例)。111例患者均在CT引导下获取肺穿刺活检标本行涂片细胞病理学检查(简称“细胞病理学检查”)，其中13例因两次细胞病理学检查不能确诊而行CT引导下粗针肺穿刺活检标本组织病理学检查(简称“组织病理学检查”)；上述标本均同时采用PCR检测结核分枝杆菌DNA(分别简称为“细胞病理学标本TB-PCR检测”与“组织病理学标本TB-PCR检测”)。

111例患者中，男71例(64.0%)，女40例(36.0%)；年龄16～79岁，平均(49.9±17.8)岁；临床表现为反复咳嗽、咳痰，伴或不伴消瘦、盗汗、胸痛、胸腔积液等症状。73例(65.8%)肺结核患者中，男48例(65.8%)，女25例(34.2%)；年龄16～79岁，平均(45.2±19.0)岁。以临床最终诊断为标准，探究细胞病理学标本TB-PCR检测诊断肺结核的检测效能(敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、正确指数)，以及组织病理学标本TB-PCR检测的检出效用。

2.诊断标准：(1)肺结核：根据新版《WS 288—2017肺结核诊断标准》[8]入组，包括①临床诊断肺结核：依据患者的结核病病史、临床表现、胸部影像学及实验室相关检查、肺外组织病理及诊断性抗结核治疗效果诊断；②确诊患者：依据痰涂片、痰培养、分子生物学、组织病理学检查诊断。(2)非结核肺部疾病：对结核病相关检查阴性或存在怀疑体征时，通过再次穿刺、组织学、细胞学检查，根据病理学及临床检测明确诊断的其他疾病，如肺癌、结节病、真菌感染等。

3.病理诊断：对首次细胞病理诊断可疑者再次行细胞病理学检查，若两次均不能确诊则穿刺或手术后取组织样本行组织病理学检查。

二、穿刺细胞病理学检查及细胞病理学标本TB-PCR检测

1.穿刺及细胞学制片：由临床医生行CT引导下经皮肺穿刺，于CT定位点处常规消毒铺巾，2%利多卡因局麻，持22 G×0.7 mm穿刺针穿刺，立即涂片1张投入95%乙醇固定15 min后采用苏木精-伊红染色法(HE染色)。针管内剩余材料打入液基瓶保存。充分振荡混匀细胞，去除血凝块、组织碎块后，放入离心机890×g离心10 min，弃上清留取沉淀，加入30 ml 液基细胞保存液(CytoRichTM)红色固定液，振荡后静置30 min，890×g离心10 min，倒掉上清并充分振荡，吸取1～5滴转移至12 ml离心管内，加入10 ml缓冲液，890×g离心5 min，倒上清并振荡，在玻片架上与离心管对应的位置上放SurePathTMPreCoat玻片，将吸液管与对应的试剂瓶正确连接，运行制片程序。

2.镜下表现：根据Bezabih等[9]的研究分型：(1)增殖型：可见类上皮细胞，包括郎罕细胞及组织细胞、淋巴细胞(增殖性肉芽肿)。(2)干酪样坏死型：可见坏死组织伴或不伴有炎症背景。(3)混合型：干酪样坏死型伴有增殖型。

3.判定标准：细胞病理学检查诊断结核病的主要依据是切片中找到干酪样坏死物、郎罕细胞和类上皮细胞，若三者同时见于细胞学切片可诊断结核病，若只出现1种或2种则为可疑结核病[10]。

4. 细胞病理学标本TB-PCR检测：(1)DNA的提取：将细胞病理学标本离心，弃上清留取沉淀，具体操作步骤严格按照核酸提取DNA说明书(厦门艾德生物有限公司)进行。(2)Stratagene Mx 3000P型荧光定量PCR仪扩增：按照结核分枝杆菌核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)说明书(北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司)进行。

三、组织病理学检查与组织病理学标本TB-PCR 检测

1.组织病理学检查：由临床医生行CT引导下经皮肺穿刺，于CT定位点处常规消毒铺巾，2%利多卡因局麻，持18 G×1.2 mm活检穿刺针穿刺。将穿刺标本放入10%甲醛固定液内送病理检查，经脱水、包埋、切片及HE染色制片。

2.病理诊断：组织病理学诊断结核病的依据：特征性病理学形态特点(坏死性肉芽肿性病变)及抗酸染色结果阳性。

3. 组织病理学标本TB-PCR检测：将组织病理学标本进一步切成蜡卷，脱蜡后进行DNA提取，所有操作、仪器、制剂的使用均同细胞病理学标本TB-PCR 检测。

四、统计学处理

采用SPSS 21.0软件对数据进行统计学处理，计数资料采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。使用敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、一致性评价细胞病理学标本TB-PCR检测诊断肺结核的检测效能。相关公式：敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%；阳性预测值=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100%；阴性预测值=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)×100%；正确指数(或一致性)=敏感度+特异度-1。

结 果

一、细胞病理学标本TB-PCR检测效能

细胞病理学标本TB-PCR检测对肺结核的检测敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、正确指数分别为83.6%(61/73)、89.5%(34/38)、93.8%(61/65)、73.9%(34/46)、0.73；单一细胞病理学检查肺结核的检测敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、正确指数分别为39.7%(29/73)、94.7%(36/38)、93.5%(29/31)、45.0%(36/80)、0.34，见表1。前者对肺结核检测的阳性率(83.6%)明显高于后者(39.7%)，差异有统计学意义(χ2=29.663，P=0.000)。

二、细胞病理学标本与组织病理学标本行TB-PCR 检测结果的比较

13例肺结核患者组织病理学标本行TB-PCR检测，阳性者8例；而细胞病理学标本行TB-PCR检测阳性者为12例。另外，73例肺结核患者中有9例经穿刺活检细胞病理学、组织病理学检查均未能诊断出肺结核，同时传统结核分枝杆菌培养及荧光抗酸染色检查等亦均阴性，细胞病理学标本行TB-PCR检测后有4例为阳性。此外，本研究有4例患者细胞病理学标本行TB-PCR 检测阳性，经再次穿刺细胞病理学检查诊断为小细胞癌1例、腺癌2例；经组织病理学检查诊断肺曲菌球病1例。

三、肺结核不同细胞学分型患者行TB-PCR检测结果分析

临床最终诊断为肺结核的73例患者中，镜下表现为增殖型9例，细胞病理学标本TB-PCR检测阳性3例(3/9)；干酪样坏死型35例，细胞病理学标本TB-PCR检测阳性32例(32/35)；混合型29例，细胞病理学标本TB-PCR检测阳性26例(26/29)。

讨 论

肺结核至今仍然是严重威胁全球人民健康的呼吸道传染性疾病，近年来结核病患者例数呈上升趋势[1,11-12]，但受患者疾病临床分期、抗生素大量使用等多种因素影响，细菌学培养阳性率较低，且诊断周期为4～6周，很难满足为患者及时制定治疗方案的临床需求[13]。在临床实践中发现，结核病与诺卡菌感染在细胞病理学检查中形态学都可见多核巨细胞及坏死，且诺卡菌抗酸染色亦可呈阳性，但诺卡菌对长周期抗生素治疗有效，因此准确的诊断是至关重要的，需要进行分子病理检测或培养加以鉴别[14]。为提高我国肺结核诊断水平，国家卫生和计划生育委员会[8]重新发布了新版《WS 288—2017肺结核诊断》，在细菌学检查的基础上，新增了分子生物学检查，强调可以以病原学、病理学结果作为确诊依据。

表1 以临床诊断为标准评价细胞病理学标本TB-PCR检测与细胞病理学检查的效能

注敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%；阳性预测值=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100%；阴性预测值=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)×100%；正确指数(或一致性)=敏感度+特异度-1

细胞病理学检查具有易于操作、技术安全、诊断迅速、准确率高等优点[15]，我院开展细胞病理学检查10余年，有丰富的细胞病理学诊断经验，如采用细胞病理学检查有明确相关疾病(包括恶性肿瘤、结核病、结节病、其他良性疾病等)的病理学诊断，临床可以根据该结果(阳性)为确诊依据制定治疗方案；若细胞病理学检查不能明确(阴性)诊断，如未见恶性病变依据或只见肉芽肿病变无法区分结核病、结节病、真菌感染等，则同期进行经皮肺穿刺、纵隔镜、胸腔镜及开胸取活检组织病理学检测为最终诊断依据[15]。细胞学病理标本TB-PCR检测有着较高的敏感度(56%)、特异度(100%)[16]，可将结核分枝杆菌染色体特异的极微量的DNA扩增百倍以上。本研究对肺结核细胞病理学标本TB-PCR检测的阳性率[83.6%(61/73)]明显高于单一细胞病理学检测肺结核的阳性率[39.7%(29/73)]，差异有统计学意义(χ2=29.663，P=0.000)。提示在细胞病理学检查的基础上增加TB-PCR检测可提高肺结核检测的阳性率，病理学检查医生在显微镜下发现可疑结核病证据后，立即行细胞病理学标本TB-PCR 检测，可极大地缩短诊断时间，为临床治疗提供方便。

细胞病理学标本TB-PCR检测可能使部分结核病患者在组织学活检和病原学均阴性的情况下减少进一步的组织学检查[16]。本研究对13例肺结核患者组织病理学标本行TB-PCR检测，阳性者8例；而细胞病理学标本行TB-PCR检测阳性者为12例，高于前者。表明细胞病理学标本行TB-PCR检测的阳性检出例数优于前者，有利于降低临床穿刺风险及减少术后并发症。但是由于样本量小，检验结果可能存在偏倚，今后需进一步收集更多样本加以验证。此外，本次研究肺结核患者中有9例经穿刺活检组织病理学检查未获得诊断依据，同时传统技术(痰涂片抗酸染色及痰培养)检测结果亦阴性，其中4例经细胞病理学标本TB-PCR检测呈阳性，进一步提示细胞病理学标本TB-PCR检测可减少进一步的组织病理学检查。

结核病常见的组织病理学改变为坏死性肉芽肿性炎，但亦可为非坏死性肉芽肿性炎，亦可见缺少肉芽肿病变的干酪样坏死结节，典型的结核结节中心为干酪样坏死，周边可见类上皮细胞和(或)郎罕细胞，外周有纤维结缔组织和慢性炎细胞浸润。本研究镜下细胞病理学与组织病理学形态相符，病变内可见类上皮细胞、干酪样坏死及郎罕细胞[17]。本研究根据细胞学形态分为增殖型、混合型及干酪样坏死型[9]。本研究73例肺结核患者中，细胞病理学标本TB-PCR检测出阳性患者干酪样坏死型(32例，32/35)及混合型(26例，26/29)的比例高于增殖型(3例，3/9)，可能与增殖期荷菌量少、毒力低，而此时人体免疫力还较强，结核分枝杆菌在结核结节形成过程中被及时清除有关。本研究仍有12例患者细胞病理学标本TB-PCR检测阴性，可能与部分患者(7例)正在或既往进行过抗结核药物治疗有关；导致病灶标本中结核分枝杆菌菌量少而难以检出，另外，穿刺活检组织位于坏死中心或穿刺时引起出血等均可明显干扰结核分枝杆菌DNA的提取。

研究表明，肺结核并发肺癌的发生率为0.22%～2.7%，并且呈逐年增加的趋势[18]，抗结核和抗肿瘤双重治疗可改善患者预后[19-20]。对于肺癌并发肺结核的患者，两病具有相似的临床症状和影像学特征，易被误诊、漏诊而影响治疗时机[21]。曲球菌常寄生于许多肺部病变构成的空洞或空腔中，如肺结核空洞、慢性肺脓肿、肺癌等[22]，也常为肺结核的并发疾病。本研究有4例细胞学病理标本TB-PCR检测阳性，经再次穿刺细胞病理学检查诊断为小细胞癌1例、腺癌2例；经组织病理学检查诊断曲菌球1例。因穿刺活检标本行细胞学检查及组织学检查时穿刺部位较局限，不能排除存在肺结核并发肺癌、曲菌球感染的情况，但在可能存在并发疾病的情况下及时发现及治疗肺结核非常必要，细胞病理学标本及组织病理学标本行TB-PCR检测可简便、快速地帮助诊断肺结核。

综上所述，细胞病理学标本TB-PCR检测是诊断肺结核的有效手段，在细胞病理学检查的基础上增加细胞病理学标本TB-PCR检测可提高肺结核检测的阳性率，在肺结核的病理诊断中具有良好的应用价值。