820例抗核抗体阳性临床标本检测结果回顾性分析

刘忻欣

（浙江大学医学院附属第四医院检验科，浙江 义乌 322000）

抗核抗体（Antinuclear antibody，ANA）是一组将自身真核细胞的细胞核成分或细胞浆中的蛋白和核酸等成分作为靶抗原的自身抗体的总称，是自身免疫性疾病（Autoimmune disease，AID）诊断的重要标志物。目前我室对临床开放的“抗核抗体常规”套餐，包含的检测主要包括间接免疫荧光法(Indirect ImmunoFluorescence，IIF)检测ANA滴度与核型，免疫印迹法（Immunoblot assay，IB）检测抗核抗体谱（ANA谱），酶联免疫吸附法（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA）检测双链DNA（double strand DNA，dsDNA）抗体，对ELISA阳性标本，使用IIF进行复检。本文通过对ANA荧光核型与dsDNA以及其他14种抗体的对比分析，探讨常见核型与ANA谱的关系、对比两种抗dsDNA检测的结果，以评价目前临床常联合检测的必要性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2016年8月～2017年7月本院抗核抗体常规检测标本，使用IIF、ELISA/IIF和IB三种方法分别检测ANA、dsDNA和ANA谱，将IIF法ANA单种荧光核型阳性（抗体滴度≥种荧光核型）共820例作为研究对象，其中女629例，年龄16～89岁；男191例，年龄13～93岁。所有标本均为患者静脉血离心分离血清。

1.2 试剂和方法

1.2.1 IIF检测ANA 采用欧盟抗核抗体IgG检测试剂盒，以猴肝、人喉癌上皮细胞（Hep-2）生物薄片检测血清中ANA，血清1：100稀释后与抗原基质于室温下温育反应30 min，使用磷酸盐缓冲液冲洗浸泡至少5 min后滴加荧光标记的抗体IgG并避光温育30 min，冲洗浸泡至少5 min后吸干边缘水分，放到滴加甘油的盖玻片上进行封片。使用荧光显微镜进行结果判读。

1.2.2 ELISA/IIF检测抗dsDNA 均采用欧蒙相应方法的抗双链DNA抗体IgG检测试剂盒。标本使用ELISA进行筛查，标本1:201倍稀释后加100后加到相应微孔，同时加入阴阳性对照及校准品，室温温育30 min后使用稀释后的清洗缓冲液清洗3次，加入酶结合物温育30 min，清洗3次后加入色原/底物液避光温育15 min，加入终止液后30 min内450 nm比色。ELISA结果≥100 IU/ml的标本，IIF复查，使用包被有绿蝇短膜虫的生物载片，样本1:10稀释，实验操作同ANA检测。

1.2.3 IB检测ANA谱 采用欧蒙欧盟抗核抗体谱IgG检测试剂盒，使用欧蒙印迹法自动操作仪（EUROBlotMaster）Euro01 AAb EL30程序进行检测。试剂膜条用清洗缓冲液充分湿润，加入1.5 ml用样本缓冲液1:100稀释的样本，室温摇床温育30 min，使用清洗缓冲液清洗3次膜条，每次5 min，向温育槽内加入用样本缓冲液1:1稀释的酶结合物，室温摇床温育30 min，使用清洗缓冲液清洗3次膜条，每次5 min，加入底物液，室温摇床温育10 min，蒸馏水清洗膜条3次，每次1 min，将膜条放置在结果判定模板中，风干后使用EUROLINE软件判读。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。采用χ2检验，P＜0.01表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ANA阳性标本荧光核型分析 820例ANA单项阳性标本，包括437例核颗粒型（53.29%），120例胞浆颗粒型（14.63%），106例着丝点型（12.93%），70例核均质型（8.54%），48例核致密颗粒型（5.85%），25例核仁型（3.05%），7例核膜型（0.85%），4例核点型（0.49%），3例其他核型（包括棒环型、染色体型、分裂期细胞纺锤体阳性等，0.37%）。核颗粒型是最常见的核型，其次是胞浆颗粒型、着丝点型。

2.2 不同核型标本对应抗dsDNA或ANA谱阳性情况 ANA阳性不同荧光核型标本对应抗dsDNA或ANA谱阳性情况，见表1。

表1 不同核型标本对应抗dsDNA或ANA谱阳性情况Table 1 Different karyotype specimens correspond to anti-dsDNAorANAspectrum positive

2.3 ELISA抗dsDNA阳性标本IIF复检阳性 ELISA抗dsDNA检测阳性标本IIF检测阳性情况，见表2。

表2 ELISA抗dsDNA阳性标本IIF复检阳性情况Table 2 ELISAanti-dsDNApositive specimens IIF retest positive

2.4 不同核型标本对应抗dsDNA或ANA谱结果 ANA阳性不同荧光核型标本对应抗dsDNA或ANA谱阳性情况，见表3。

2.5 几种主要荧光核型的最常见抗体与非该核型组相比采用χ2检验，见表4。

3 讨论

AID是一组异质性、以机体免疫系统攻击自身一种或多种细胞成分，最终导致器官和组织损伤为特征的疾病。目前AID的诊断标准之一就是检出特异或相关性的自身抗体[1]。临床检测ANA最为常用的方法是IIF，它检测灵敏度高、操作方便，且能够检出针对胞核、胞浆、细胞骨架及细胞周期等多种成分的自身抗体，具有检测范围广的优点，被看作是“金标准”[2]。我室目前采用欧蒙IIF试剂盒检测ANA，为3.2倍滴度系统，临界值为1:100（±），由于老龄人群和某些特定生理阶段ANA检测可能会显示低滴度阳性[3]，本次研究选取ANA滴度1:320（＋）及以上单项阳性共820例样本作为研究对象。研究结果显示820例ANA阳性标本中，核颗粒型占53.29%，胞浆颗粒型占14.63%，着丝点型占12.93%，核均质型占8.54%，核致密颗粒型占5.85%，核仁型占3.05%，核膜型0.85%，核点型占0.49%，各核型阳性率与国内曾有报道存在一定偏差[4]。分析原因，可能由于选取滴度标准，因时间、地域、人群差异导致的群体疾病谱构成差异。同时，不同实验室的检测程序、试剂盒、稀释倍数及报告者的主观影响也会对阳性率造成影响。此外，本次研究将核致密颗粒型（DFS）纳入统计，目前对于该核型的研究认为其无特异性，是正常人群中最常见的ANA高滴度核型[5]，而当滴度在1:320以上时AID患者阳性率高于非AID患者[6]，由于其荧光形态易与均质型和颗粒型混淆而误导临床，故已在国际共识中被列为一级必报核型[7]，这也导致本研究核型统计差异于以往报道。820例IIF阳性标本中，抗体检出阳性率为73.9%，低于同类文献报道[4]。究其原因，除了本研究只覆盖了抗dsDNA和14种ANA谱条带而可能产生遗漏以外，还可能是对于仅检出抗Sm弱阳性的标本，我室结合抗nRNP阴性通常认为抗Sm出现假阳性而修正了报告。820例ANA阳性中，ELISA检测抗dsDNA阳性率为0.85%，低于文献报道[4]，可能是由于实验方法不同引起的。实验中观察到未被我室作为结果报告的ANA谱条带中抗dsDNA阳性率明显高于ELISA，但具体数据难以统计。对于ELISA检测阳性标本复查IIF发现，核均质型100%为IIF阳性，而核颗粒型则33.33%IIF阳性，总复检阳性率71.42%，认为ELISA检测抗dsDNA存在假阳性，且在核颗粒型中更常见，但此次样本数太少，若需证实还需要进一步的研究。曾有国内文献报道使用两种方法联合检测系统性红斑狼疮（SLE）患者抗dsDNA，同时存在ELISA＋IIF－和ELISA－IIF＋结果，且两种方法结果差异无统计学意义[8]。而国外学者通过随访实验证实，抗dsDNA阳性出现于ANA核均质型的比率高于核颗粒型，且对于ANA阳性标本患者使用两种以上定量方法联合检测抗dsDNA，其阳性结果对SLE的诊断具有更高的特异性[9]。

表3 不同核型标本对应抗dsDNA或ANA谱结果Table 3 Results of anti-dsDNAorANAspectra for different karyotype specimens

表4 主要核型最常见抗体与非该核型组结果比较Table 4 Comparison of the Results of the most common karyotype antibodies and non-nuclear group

研究结果显示，核颗粒型中，最常见抗体为抗SSARo52（55.15%）、抗 SSA（57.89%）、抗 SSB（21.05%）和 抗 nRNP（26.77%）；胞浆颗粒型中，最常见抗体为抗AMA M2（30%）；着丝点型中，最常见抗体为抗CENP B（98.11）；核均质型中，最常见抗体为抗核小体（32.86%）和抗组蛋白（21.43%）。以上与非该核型组相比差异均有统计学意义（P＜0.01），特别是抗CENP B对着丝点型具有很高特异性。

本次研究证实了ANA荧光核型与ANA谱相关抗体之间的联系，对于临床的报告和诊断具有参考意义，但数据中也可发现核型与具体抗体并无绝对的相关性。并且，由于受到本室实验操作和人员经验的限制，可能发生一定的遗漏、判读偏差及存在低滴度混合核型的情况，所以我室设置相抗核抗体常规套餐”通过联合检测，同时应用多种实验方法，并同时结合ANA滴度、核型、ANA谱、临床症状、体征以及其他实验室检测结果（如血常规、血沉、特定蛋白、其他特征性抗体等），以期能够综合判断，出具更符合临床的实验报告。而国内外研究也在探索不同检测方法新的组合模式或检验程序，致力于支持AID的诊断[10]。