E6/E7 mRNA检测在高危型人乳头瘤病毒DNA阳性且细胞学轻度异常患者随访中的作用

王兰英，施姚，张生枝，徐瑛，何燕，朱雪琼

（1.温州医科大学附属第二医院 妇产科，浙江 温州 325027；2.余姚市人民医院 妇产科，浙江 宁波315400）

宫颈癌是全球妇女中第三常见的恶性肿瘤[1]，宫颈癌前病变的筛查仍是预防宫颈癌的主要手段。无明确诊断意义的不典型鳞状细胞（atypical squamous cell of undetermined significance，ASCUS）和低度鳞状上皮内病变（low-grade squamous intraepithelial lesions，LSIL）在宫颈细胞学筛查异常结果中是最常见的。ASCUS及LSIL约占宫颈脱落细胞学的10%～20%，而ASCUS和LSIL的CINII+病变率约为15%[2]，因此合理处理ASCUS及LSIL一直是临床医师面临的实际问题之一。研究表明，E6E7 mRNA检测的敏感性和HPV DNA相当，而特异性更好[3-4]，因此E6/E7 mRNA成为筛选HPV DNA阳性而细胞学轻度异常（ASCUS及LSIL）患者的生物标志物[5]。本研究主要对HPV DNA阳性，细胞学轻度异常（ASCUS或LSIL）且阴道镜下活检病理学结果为CINII-的患者行E6/E7 mRNA测定，并分析随访2年后CINII+的发生率，探讨对HPV DNA阳性且细胞学轻度异常（ASCUS或LSIL）、阴道镜下活检病理学结果为CINII-患者的合理处理方法。

1 对象和方法

1.1 对象 收集余姚市人民医院门诊2015年1月至2015年12月薄层液基细胞学检测（thinprep cytologic test，TCT）结果为ASCUS或LSIL、HPV-DNA高危阳性的女性患者332例，年龄30～65岁。排除妊娠、既往因宫颈病变行手术治疗、盆腔放射史、子宫切除病史者。均行HPV E6/E7 mRNA检查，均在签署知情同意书后行阴道镜下活检及病理学检查。

1.2 方法

1.2.1 TCT方法：TCT毛刷取材，取材前应禁止性生活及阴道冲洗3 d，取材位置在宫颈管及鳞柱上皮交界处，向同一方向旋转5圈，将细胞刷洗在TCT专用取样瓶中，经TCT专用制片机制成薄层涂片，样本经巴氏染色后镜检。

1.2.2 HPV DNA检测：暴露宫颈后，采用HPV专用毛刷，伸入宫颈口，顺时针旋转3～5圈，将刷头折断保存在HPV专用取样瓶中。采用PCR反向点杂交技术，按照试剂盒说明进行操作。HPV毛刷、细胞保存液、试剂盒及仪器均购自深圳亚能生物技术有限公司，试剂批号为：201507211。

1.2.3 HPV E6/E7 mRNA检测：利用TCT剩余标本检测HPV E6/E7 mRNA。试剂盒和仪器均购自郑州中美合资科蒂亚生物技术有限公司，试剂批号为：1501a1。由实验人员记录标本编号，事先对标本诊断不知情，严格按照试剂盒说明进行操作。Quanti-Virus-tm冷光仪检测标本，检测结果为光子数，经计算机软件转换为拷贝数。

1.2.4 组织病理学检查：由护士登记患者资料后，妇产科阴道镜专科医师对患者行阴道镜下检查，涂碘液后，对可疑病灶进行定位活检。标本制片由病理科医师完成。诊断分为：正常或炎症，宫颈上皮内瘤变，浸润癌。

1.2.5 随访：病理检查结果为CINII-的患者定为随访对象，随访间隔为6个月，随访总时间为24个月。随访方式为TCT检查、宫颈HPV检测、阴道镜下检查及宫颈活检。随访期间高危型HPV阳性病例在自愿的原则下均接受正规疗程的抗病毒治疗，治疗药物均为同一种药物。随访终点为：①阴道镜下病理活检为CINII+；②TCT及HPV检查均转为阴性；③到达随访时间2年。随访期间出现妊娠或因其他原因行子宫切除术的视为无效。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS19.0软件进行统计学分析。率的比较采用χ2检验，随访资料采用Kaplan-Meier法分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

332例高危HPV DNA阳性患者中，ASCUS共154例（占46.4%），LSIL共178例（占53.56%），其中E6/E7 mRNA阳性204例（占61.4%），阴性128（占38.6%），初次阴道镜下活检病理分布情况见表1。E6/E7 mRNA阳性组CINII+发生率为42/204（20.6%），阴性组为13/128（10.2%），差异有统计学意义（χ2=5.46，P=0.02）。

表1 332例患者初次阴道镜检查结果（例）

阴道镜下检查无可疑病灶及病理结果为炎性病变及CINI的患者共277例进入随访，随访期间有17例失访，2例妊娠，1例行子宫切除术，最终257例（E6/E7 mRNA阳性组158例，阴性组99例）患者完成随访（24个月），E6/E7 mRNA阳性组共发生CINII+ 33例（占20.89%），阴性组发生CINII+ 7例（占7.07%），累积疾病进展率的差异有统计学意义（P=0.002），见图1。

图1 全部患者E6/E7 mRNA阳性组和阴性组随访24个月的疾病进展情况

非绝经患者187例，E6/E7 mRNA阳性116例，阴性71例，阳性组共发生CINII+ 20例（占17.24%），阴性组共发生CINII+ 5例（占7.04%），累积疾病进展率的差异有统计学意义（P=0.013），见图2。

图2 非绝经患者E6/E7 mRNA阳性组和阴性组随访24个月的疾病进展情况

绝经患者70例，其中E6/E7 mRNA阳性42例，阴性28例，阳性组共发生CINII+ 13例（占30.95%），阴性组共发生CINII+ 2例（占7.14%），累积疾病进展率的差异有统计学意义（P=0.045），见图3。

E6/E7 mRNA阴性组随访6个月时无CINII+病例出现，阴性预测值为100%，12个月时出现CINII+病例1例，随访结束共出现7例，2年阴性预测值为93.2%。E6/E7 mRNA阳性组随访6个月时有3例CINII+病例发生，随访结束共有33例，阳性预测值为22.4%；E6/E7 mRNA检测预测CINII+的特异性是42.4%。见表2。

图3 绝经患者E6/E7 mRNA阳性组和阴性组随访24个月的疾病进展情况

3 讨论

高危型HPV DNA持续感染是绝大多数癌前病变和宫颈癌发生的主要原因。HPV相关的生物标志物E6/E7 mRNA是致癌基因E6/E7表达的直接产物，是导致宫颈病变开始和进展的必要条件，更能体现HPV致癌基因的活动程度并预测病情[6]。本研究经过2年的随访发现细胞学轻度异常（ASCUS或LSIL）的高危型HPV DNA阳性患者中，E6/E7 mRNA阳性者发生CINII+风险显著高于阴性者，HPV E6/E7 mRNA预测CINII+发生的特异性是42.4%，阳性预测值为22.4%，阴性预测值为93.2%。

绝经后由于鳞柱交界上移，TCT及阴道镜检查准确率下降[7]，对这部分人群进行合理的癌前筛查，能有效降低宫颈癌的发病率。ASCIUTTO等[8]报道，在绝经人群中，E6/E7 mRNA预测CINII+的特异性达到60.2%，可作为分流ASCUS及LSIL的生物标志物。本研究也表明，在绝经人群中，E6/E7 mRNA阳性患者疾病的进展风险高于阴性组。在绝经人群E6/E7 mRNA阴性组随访18个月始出现1例CINII+，故对于细胞学轻度异常（ASCUS或LSIL）的高危HPV DNA阳性的绝经患者，若E6/E7 mRNA阴性，可延长随访间隔时间，避免频繁的阴道镜检查。

表2 E6/E7 mRNA阳性组和阴性组随访24个月CINII+的发生情况

在过去的50多年，大多数国家采用宫颈细胞学为全部适龄女性筛查方案，有效降低了宫颈癌的发病率[9]。一项荟萃分析表明宫颈ASCUS和LSIL的高危型HPV DNA的感染率分别达到了43%和76%，而大约91%的HPV阳性患者能够在半年至2年后转阴，71%的患者细胞学转至正常[10]。HPV DNA检查较低的特异性增加了不必要的阴道镜检查及医疗资源的浪费。而本研究中HPV E6/E7 mRNA预测CINII+的特异性是42.4%，和PERSSON等[11]研究HPV E6/E7 mRNA在预测CINII+的特异性为50%相似，而明显高于JOHANSSON等[12]的5.4%～12.7%。这可能与基线HPV E6/E7mRNA阳性率有关，JOHANSSON等的研究中基线HPV E6/E7 mRNA阳性率为92.1%，而本研究为61.4%。

随访中发现，E6/E7 mRNA阳性患者随访6个月后有3例CINII+病例发现，而这3例均为HPV16/18阳性患者，预示着细胞学轻度异常（ASCUS或LSIL）的高危HPV DNA阳性患者，当E6/E7 mRNA和HPV16/18同时阳性时，应缩短随访时间，加大阴道镜检查的频率，减少漏诊率。而针对E6/E7 mRNA阴性患者，随访6个月时并无CINII+病例发生，随访12个月出现1例，表明对于细胞学轻度异常（ASCUS或LSIL）的高危HPV DNA阳性患者，即使E6/E7 mRNA阴性也应随访，但可延长随访间隔时间，减少阴道镜检查次数，这与PERSSON等[11]观点基本一致。需要指出的是E6/E7 mRNA阴性的患者，随访24个月并无CINIII+及宫颈癌的发生，对CINIII+的阴性预测值达到100%，与JOHANSSON等[12]的结论是一致的。

随着随访时间的延长，E6/E7 mRNA阳性患者发生CINII+的累积风险是增加的，24个月随访结束时E6/E7 mRNA阳性患者发生CINII+的病例数明显多于前3次随访的病例数。

总之，对高危型HPV DNA阳性、TCT为ASCUS或LSIL的患者随访中，无论其是否绝经，HPV E6/E7 mRNA检测可作为分流此类患者的有效生物标志物。当E6/E7 mRNA阳性，尤其合并HPV16/18阳性时，应缩短随访间隔时间。随随访时间延长，若两者均持续阳性，应加大阴道镜检查的频率，以降低漏诊率。E6/E7 mRNA阴性患者也应随访，但可延长随访间隔时间，以减少阴道镜检查次数。但由于病例数及随访时间仍有限，更确切的结论尚待进一步的随访观察。