IGFBP-4在灯盏花素抑制肺癌A549细胞增殖中的作用

孙蕾，李伟文，黎媛，蓝秀，吕祝庆

（浙江大学丽水医院 温州医科大学附属第五医院 丽水市中心医院 呼吸科，浙江 丽水 323000）

肺癌是高发病率和病死率的恶性肿瘤，在我国肺癌发病率高达54/10万，病死率达46/10万[1-2]。尽管放化疗、靶向药物治疗、免疫治疗等治疗延长了部分患者的生存时间，但极大部分患者仍难以获得满意的临床效果。研究证实从中药提取的单体及其衍生物具有显著的抗肿瘤作用[3-4]。灯盏花素（breviscapine，BVP）是灯盏花主要提取成分，具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、改善循环和神经保护等作用。研究证实BVP具有显著的抗肿瘤作用，包括肝癌、结直肠癌、胃癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤[5-6]。也有研究证实BVP具有抗肺癌的作用[7]，但其机制仍未完全明确。本研究将通过多种方法探索BVP对肺癌A549细胞增殖的影响，并初步研究其可能的分子机制，为临床应用BVP治疗肺癌提供科学根据。

1 材料和方法

1.1 材料 肺癌A549细胞购买于上海生命科学细胞库。BVP购自上海融禾医药科技发展有限公司（纯度≥98%），MTT、DMSO、台盼蓝购自美国Sigma公司，β-肌动蛋白、Bcl-2、Bax单克隆抗体购自美国Cell Signal Technology公司；胰岛素样生长因子结合蛋白4（Insulin-like growth factor binding protein-4，IGFBP-4）抗体购自德国R&D Systems公司，IGFBP-4 ELISA试剂盒购自上海信裕生物科技有限公司，Adv-IGFBP-4-OETMDNA、EGFP和Adv-KDTMEasy RNAi EGFP腺病毒购自上海吉凯基因化学技术有限公司，qRT-PCR相关试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 肺癌A549细胞培养：使用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基（含100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素）培养，将A549细胞接种于培养皿后，置入37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。

1.2.2 MTT法检测细胞生长存活率：调整A549细胞密度为2×104/mL，接种于96孔培养板，每孔200 μL，过夜，加药后，置于培养箱中继续培养48 h。加入20 μL MTT，37 ℃温箱孵育2 h后，用DMSO 120 μL终止反应。以调零孔吸光度（A）值调零校准，酶标仪在492 nm波长处检测A值。细胞存活率（%）=（各浓度组A值/对照组A值）×100%。

1.2.3 台盼蓝染色：1×106个A549细胞接种于6孔板，0、25、50和100 μmol/L BVP处理48 h，收集细胞，加入1 mL PBS洗涤3次，细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9∶1混合均匀（终浓度0.04%），3 min内镜像观察死细胞和活细胞情况。统计死细胞率（%）=死细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%。

1.2.4 细胞凋亡检测：用1×106个A549细胞接种于6孔板，经0、25、50和100 μmol/L BVP处理48 h后，收集细胞，加入1 mL PBS洗涤3次，再加入500 μL Binding buffer，并依次加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL PI，室温下避光孵育15 min，用流式细胞仪检测。

1.2.5 Western blot检测：1×106个A549细胞接种于6孔板，加药48 h后，PBS漂洗2次后，加入细胞裂解液冰上裂解15 min，12 000 r/min离心15 min，吸取上清。经BCA法定量后，取20 μg总蛋白4%～12%聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳分离，电转至PVDF膜上，3%脱脂牛奶室温封闭1 h。加入一抗4 ℃孵育过夜，随后PBST缓冲液洗PVDF膜3次，每次8 min，加入HRP标记的二抗室温孵育1～2 h，再用PBST缓冲液洗PVDF膜3次，每次8 min，ECL试剂发光、显影和定影，并用Image J软件进行分析。

1.2.6 ELISA检测：1×106个A549细胞接种于6孔板，过夜，加入0、25、50、100 μmol/L BVP加药处理48 h，用无菌管收集细胞培养基上清，经离心20 min（2 000～3 000 r/min），仔细收集上清，按照ELISA试剂盒说明书步骤操作后，设置酶标仪波长为450 nm，并依序测量各孔的吸光度（A）。IGFBP-4相对比值=（实验组平均A值/对照组平均A值）。

1.2.7 RT-qPCR检测：加药处理48 h后，采用TRIZOL法抽提组织总RNA，并按照说明书步骤合成cDNA，接着进行荧光定量PCR，反应体系为25 μL，使用GAPDH作为内参照，引物系列如下：IGFBP-4：上游5’-GGGTGTTCTCTTTGGTGTTA-3’，下游5’-TGTTTTTAGGT GGCTGGATG-3’；GAPDH：上游5’-CTCCTCCTGTTCGACA GTCAGC-3’；下游5’-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3’；采用ΔΔCt法分析IGFBP-4 mRNA的表达量。

1.2.8 IGFBP-4腺病毒感染：按照说明书，用5×103个A549细胞接种于96孔培养板，每孔体积为100 μL。融合率为40%～50%时进行病毒感染。取10 μL腺病毒原液稀释到10-7，未加入病毒的细胞孔中加入同样量的完全培养基作为对照组，置于培养箱继续培养，8～12 h以后观察细胞状态。在感染后12、24、48 h观察细胞中荧光表达情况，并获取高表达或者低表达IGFBP-4的A549细胞，并用Western blot进行验证。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS22.0软件进行处理，计量资料以表示，采用单因素方差分析进行显著性检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BVP抑制A549细胞存活 与对照组相比，经终浓度为25、50和100 μmol/L BVP处理48 h后，MTT结果显示A549细胞存活率显著降低，台盼蓝染色示A549细胞死亡比例显著提高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

2.2 BVP诱导A549细胞凋亡 流式细胞仪分析结果显示，与对照组比，25、50和100 μmol/L的BVP处理48 h后，A549细胞的凋亡率均明显增加，Western blot分析结果显示Bcl-2蛋白相对表达量降低，而Bax蛋白相对表达量增加，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图1 BVP抑制A549细胞存活

图2 BVP对A549细胞凋亡的影响

2.3 BVP促进A549细胞IGFBP-4表达 Western blot和RT-qPCR检测结果显示，与对照组相比，25、50、100 μmol/L BVP处理48 h后，A549细胞IGFBP-4蛋白和mRNA表达量升高，ELISA结果显示培养基中IGFBP-4的含量显著增高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

2.4 IGFBP-4高表达对BVP诱导A549细胞增殖抑制的影响 NC-OE（空载体）和IGFBP-4-OE（高表达）感染A549细胞后，与NC-OE细胞比，IGFBP-4-OE细胞存活率降低，Bax表达增加，Bcl-2表达降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；经100 μmol/L BVP处理48 h后，与NC-OE细胞相比，IGFBP-4-OE细胞存活率显著降低，Bax表达增加，Bcl-2表达降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；在IGFBP-4-OE细胞中，BVP处理后，细胞存活率减低，Bax表达增加，Bcl-2表达降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图4。

2.5 IGFBP-4低表达对BVP诱导A549细胞增殖抑制的影响 NC-KD（空载体）和IGFBP-4-KD（低表达）感染A549细胞后，与NC-KD细胞相比，IGFBP-4-KD细胞存活率增加，Bax表达降低、Bcl-2表达增加，差异均有统计学意义（P＜0.05）；经100 μmol/L BVP处理48 h后，与NC-KD细胞相比，IGFBP-4-KD细胞存活率增加，Bax表达降低、Bcl-2表达增加，差异均有统计学意义（P＜0.05）；在IGFBP-4-KD细胞中，经BVP处理后，细胞存活率降低，增加Bax表达，Bcl-2表达降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图5。

3 讨论

图3 BVP对A549细胞IGFBP-4表达的影响

图4 IGFBP-4高表达对BVP诱导A549细胞增殖抑制的影响

BVP是一种从灯盏花提取的天然黄酮类混合物，其主要成分包括灯盏花甲素、灯盏花乙素及咖啡酰奎宁酸酯类。BVP具有抗肿瘤作用，WU等[5]研究发现BVP通过上调Cyt C、Caspase3、Bax，下调抗凋亡蛋白Bcl-2抑制肝癌细胞增殖。KE等[8]研究发现BVP抑制STAT3/AKT通路降低肝癌细胞迁移、降低肿瘤侵袭能力。GUAN等[9]发现BVP能够诱发前列腺癌DNA损伤，促进细胞凋亡，抑制肿瘤生长。也有研究证实BVP能够通过上调miRNA-7抑制肺癌细胞增殖[7]。但BVP的抗肺癌作用及其抗癌机制的相关报道仍十分缺乏。本研究中，我们发现BVP能够显著降低肺癌A549细胞的增殖和细胞活性，促进细胞凋亡；分子水平上，BVP能够显著增加Bax表达，而降低Bcl-2的表达，说明BVP具有抗A549细胞增殖，诱导A549细胞凋亡的作用。

图5 IGFBP-4低表达对BVP诱导A549细胞增殖抑制的影响

IGFBP-4是由位于17q12-q21.1，长度约2 246 bp基因编码的237个氨基酸，广泛分布于全身多个器官，也可分泌到血液。IGFBP-4作为负性调控因子，与肿瘤生长呈负相关关系[10]。IGFBP-4能够增加肿瘤组织内细胞凋亡比例，抑制荷瘤形成[11]。然而，在肺癌组织中IGFBP-4呈低表达，被认为可能是肺癌细胞增殖、迁移的重要原因之一[12-13]。近年来有研究证实IGFBP-4抑制肺癌肿瘤微环境中A549细胞侵袭、迁移能力[14]；但也有研究显示IGFBP-4与预后不良有关[12]。在本研究中，BVP能够增加IGFBP-4 mRNA和蛋白的表达，并增加IGFBP-4的分泌。IGFBP-4高表达能够降低A549细胞存活率，增加Bax、降低Bcl-2的表达，说明IGFBP4具有抑制A549细胞增殖的作用。与NC-OE细胞相比，BVP处理后，IGFBP-4高表达细胞的存活率显著下降，Bax表达增加、Bcl-2表达降低，说明IGFBP-4参与了BVP诱导A549细胞增殖抑制。与NC-KD细胞相比，IGFBP-4低表达细胞增殖活性增加，Bax表达减低、Bcl-2表达增加，说明敲低IGFBP-4有利于A549细胞增殖。经BVP处理后，空载体细胞存活率较IGFBP-4低表达细胞明显下降，说明敲低IGFBP-4抑制了BVP抗A549增殖作用。然而，在IGFBP-4低表达细胞中，经BVP处理后，细胞存活率仍降低，提示BVP可能还通过其他途径发挥抗A549细胞增殖作用。

综上所述，BVP具有抑制A549细胞增殖，诱导细胞凋亡的作用，其机制可能与BVP促进IGFBP-4表达增高有关。