MicroRNA-29b对肝纤维化及肝星状细胞增殖、凋亡的影响

（河南大学淮河医院 感染科，河南 开封 475000）

肝纤维化并非一种独立疾病，而是伴发于多种慢性肝病的肝脏病变。近年来，我国肝纤维化发病率逐渐上升，若不及时治疗，肝内纤维组织大量增生，由肝纤维化发展到肝硬化，严重威胁患者的生命健康[1]。肝星状细胞（hepatic stellate cell, HSC）的激活在肝纤维化发展过程中发挥重要作用[2]。MicroRNA（miRNA）主要调控细胞的增殖、分化、凋亡。较多研究证实，miRNAs与HSC向成纤维细胞发展有关，其中miR-29b在多种肿瘤中表达下调，被认为是肿瘤抑制型miRNA[3-4]。关于miR-29b与肝纤维化的研究已有较多报道，但是HSC中miR-29b的研究较少[3-4]。本研究通过CCl4复制肝纤维化模型，旨在探究miR-29b在肝纤维化过程中的作用及其对HSC的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级SD大鼠20只，8周龄，体重200 g，由上海医科大学动物实验中心提供，合格证号：SYXK（沪）2014-0004，所有动物在统一环境中饲养，温度25℃，湿度65%，严格按照动物饲养规则进行喂养。

肝星状细胞HSC-T6、LX-2购自北京医科大学肝病研究中心，来源于美国标准生物品收藏中心，保存于-80℃。

1.2 主要试剂与仪器

CCl4（美国RD公司）使用前加入中性菜籽油进行稀释，调整浓度为600 ml/L。兔抗大鼠转化生长因 子 -β1（tansforming growth factor-β1, TGF-β1）、SAMD3（sterile alpha motif domain containin protein 3）单克隆抗体一抗、辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase, HRP）标记山羊抗兔二抗购自美国Santacruz公司，RNA提取试剂盒（北京生化科技有限公司），逆转录试剂盒（日本TaKaRa公司），BCA测定试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司），LipofectamineTM2000转染试剂（美国Invitrogen公司，miR-29b siRNA正向引物：5'-TGCGCTAGCACCATT TGAAATC-3'；反向引物：5'-CCAGTGCAGGGTCCG AGGTATT-3'），光学显微镜（上海光学仪器厂），实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）仪（美国BioRed公司）。

1.3 方法

1.3.1 动物模型的复制 将大鼠随机分为对照组和模型组，每组10只。模型组大鼠经腹部注射60%3 ml/kg CCl4，2次/周，对照组以同样方式注射等量生理盐水。在第0、6和12周，大鼠禁食12 h，腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥钠进行麻醉，切开腹部皮肤，取出肝脏组织，留取一部分在4%多聚甲醛中固定，另一部分保存在-80℃冰箱备用。

1.3.2 苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining）大鼠肝组织行HE染色。常规制备石蜡切片浸入二甲苯固定30 min，在质量分数为100%、95%、85%和75%的乙醇溶液中分别脱水5 min，流水冲洗后，加入苏木精染色10 min，浸入1%盐酸后用蒸馏水冲洗。均加入伊红液染色3 min，依次在75%、85%、95%和100%乙醇溶液中脱水2 min，加入二甲苯透明处理，滴加中性树脂封片，放置于显微镜下观察，选取5个视野计算纤维化面积，无纤维化为0分，纤维化面积＜25%为1分，25%～50%为2分，50%～75%为3分，＞75%为4分。

1.3.3 实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative realtime polymerase chain reaction, qRT-PCR） 采 用qRT-PCR检测肝组织中miR-29b、TGF-β1、SAMD3基因的表达。取出冷冻肝组织，用无菌剪刀将组织剪碎，采用RNA提取试剂盒提取肝脏总RNA，按照逆转录试剂盒说明书进行操作，将RNA逆转录为cDNA，qRT-PCR引物由广州Invitrogen公司合成，引物序列见表1。反应体系：10×cDNA模板1μl，正反向引物各 1μl，H2O 8μl，10μl 2×SYBR Mix。反应条件：95℃预变性2 min，95℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，共35个循环，72℃继续延伸10 min。在CFX manager 3.0软件上以GAPDH作为内参基因，采用2-ΔΔCt法行基因相对定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.4 Western blot检测 采用Western blot检测肝组织中TGF-β1、SAMD3的蛋白表达。将肝脏组织剪碎后加入蛋白裂解液，在冰上反应30 min，离心后收集上清液，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，制备8%分离胶、12.5%浓缩胶，蛋白上样量统一为30μg，电泳开始时电压设置为80 V，进入分离胶后，电压调整为120 V，电泳结束后转移蛋白凝胶至PVDF膜上，转膜反应在冰上进行，电压设置为100 V，转膜反应1 h，加入TBST溶液清洗后，加入5%脱脂牛奶，室温下封闭1 h，TBST溶液清洗PVDF膜，加入一抗稀释液（TGF-β1、SAMD3抗体），4℃震荡过夜，PBST清洗3次，加入二抗稀释液，室温下孵育2 h，PBST清洗。凝胶成像仪观察蛋白的表达。

1.3.5 miR-29b转染HSC-T6、LX-2细胞 采用含10% FBS的DMEM培养基，置于37℃、5%二氧化碳CO2培养箱中培养HSC-T6、LX-2细胞。细胞贴壁生长后，加入0.25%胰蛋白酶溶液消化，生长至80%时，加入DMEM培养基终止消化。将细胞随机分为空白对照组、miR-29b转染组、阴性转染组。miR-29b转染组、阴性转染组参照转染试剂盒分别转染miR-29b siRNA和无意义对照序列，置于37℃、5% CO2培养箱中培养48 h。

1.3.6 MTT法 采用MTT法检测HSC-T6、LX-2细胞的增殖。收集培养后的细胞制备单细胞悬浮液，调整细胞密度为5×104个/ml，置于37℃、5% CO2培养箱中分别培养12、24、48和72 h，加入10μl MTT孵育4 h，加入100μl DMSO溶液，在570 nm波长处测定吸光度值（OD值）。细胞抑制率=（OD实验组-OD空白对照组）/OD空白对照组×100%。

1.3.7 流式细胞术 采用流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡的变化。收集培养后的细胞制备单细胞悬浮液，调整细胞密度为5×104个/ml，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，当细胞生长至80%时，加入0.25%胰蛋白酶消化细胞，收集细胞后加入预冷PBS溶液洗涤，70%乙醇溶液中固定1 h，PBS清洗，加入PI染色重悬后置于流式细胞仪中检测细胞周期变化。在细胞悬浮液中加入Annexin V-APC，室温下黑暗中孵育15 min，用细胞流式仪检测细胞凋亡情况。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用单因素方差分析或重复测量设计的方差分析，两两比较用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肝纤维化状况

HE染色结果显示，对照组大鼠肝脏组织细胞形态正常结构完整，呈四周放射样整齐排列；模型组大鼠肝组织出现纤维增生，结构遭到破坏，存在炎症细胞浸润，随着时间的延长肝纤维化程度逐渐加重。对照组第0周大鼠肝组织纤维化评分为（0.00±0.00）分，模型组第0、6和12周大鼠肝组织纤维化评分分别为（0.97±0.13）、（1.66±0.15）和（2.57±0.32）分，经方差分析，差异有统计学意义（F=4.032，P=0.000）。进一步两两比较经SNK-q检验，模型组第6周大鼠肝组织纤维化评分高于模型组第0周（P＜0.05）；模型组第12周大鼠肝组织纤维化评分高于模型组第6周（P＜0.05）。见图 1、2。

2.2 各组大鼠肝组织中 miR-29b、TGF-β1、SAMD3表达水平

对照组、模型组大鼠不同时间miR-29b、TGF-β1、SAMD3相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2和图3、4。

2.3 miR-29b对HSC-T6、LX-2细胞增殖的影响

空白对照组、阴性转染组、miR-29b转染组12、24、48和72 h的HSC-T6细胞抑制率比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的细胞抑制率有差别（F=36.675，P=0.000）；②3组细胞抑制率有差别（F=9.566，P=0.000）；③3组细胞抑制率变化趋势有差别（F=48.755，P=0.000）。

空白对照组、阴性转染组、miR-29b转染组12、24、48和72 h的LX-2细胞抑制率比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的细胞抑制率有差别（F=35.258，P=0.000）；②3组细胞抑制率有差别（F=5.810，P=0.000）；③3组细胞抑制率变化趋势有差别（F=12.908，P=0.000）。见表3和图5。

图1 各组大鼠肝组织 （HE×100）

图2 各组大鼠肝组织纤维化评分比较 （n =10，±s）

图3 各组大鼠肝组织中miR-29b、TGF-β1、SAMD3基因表达水平比较 （n =10，±s）

表2 各组大鼠肝组织中miR-29b、TGF-β1、SAMD3表达水平比较 （n =10，±s）

表2 各组大鼠肝组织中miR-29b、TGF-β1、SAMD3表达水平比较 （n =10，±s）

注：1）与对照组比较，P ＜0.05；2）与模型组第0周比较，P ＜0.05；3）与模型组第6周比较，P ＜0.05

SAMD3基因 蛋白 基因 蛋白对照组 0.98±0.10 0.26±0.04 0.29±0.03 0.23±0.03 0.36±0.06模型组第0周 0.78±0.151） 0.43±0.081） 0.41±0.061） 0.39±0.061） 0.43±0.051）模型组第 6周 0.67±0.141）2） 0.54±0.091）2） 0.78±0.111）2） 0.46±0.111）2） 0.72±0.091）2）模型组第 12 周 0.52±0.121）2）3） 0.82±0.061）2）3） 1.12±0.141）2）3） 0.76±0.141）2）3） 1.17±0.071）2）3）F值 11.417 58.591 79.247 27.559 143.552 P值 0.003 0.000 0.000 0.000 0.000 TGF-β1组别 miR-29b

2.4 miR-29b对HSC-T6、LX-2细 胞 周 期 的影响

空白对照组、阴性转染组、miR-29b转染组HSC-T6、LX-2细胞G1期比例比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=5.048和3.605，P=0.014和0.041）。进一步两两比较经SNK-q检验，HSC-T6、LX-2细胞miR-29b转染组G1期比例[（62.34±13.66）%和（56.83±8.28）%]均高于空白对照组[（49.73±7.56）%和（50.34±9.65）%]、阴性转染组[（48.23±10.64）%和（46.79±8.35）%]。见图6。

空白对照组、阴性转染组、miR-29b转染组HSC-T6、LX-2细胞S期比例比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=14.091和4.418，P=0.000和0.022）。进一步两两比较经SNK-q检验，HSC-T6、LX-2细胞S期比例[（25.37±6.24）%和（30.36±5.47）%]低于空白对照组[（38.51±6.64）%和（39.65±9.64）%]、阴性转染组 [（39.76±7.23）%和（36.74±5.52）%]。见图6。

图4 各组大鼠肝组织中miR-29b、TGF-β1、SAMD3蛋白表达水平比较 （n =10，±s）

2.5 miR-29b对HSC-T6、细胞凋亡的影响

空白对照组、阴性转染组、miR-29b转染组HSC-T6、LX-2细胞凋亡率比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=100.553和97.438，均P=0.000）。进一步两两比较经SNK-q检验，miR-29b转染组HSC-T6、LX-2细胞凋亡率[（23.64±6.37）%和（20.13±5.26）%]高于空白对照组[（3.16±0.87）%和（3.83±0.76）%]、阴性转染组[（3.07±0.75）%和（2.98±0.72）%]。见图 7。

表3 转染后HSC-T6、LX-2细胞抑制率比较 （%，±s）

表3 转染后HSC-T6、LX-2细胞抑制率比较 （%，±s）

注：†与空白对照组、阴性对照组比较，P ＜0.05

LX-2 12 h 24 h 48 h 72 h 12 h 24 h 48 h 72 h空白对照组 6.13±0.87 6.26±0.79 6.14±0.88 6.28±0.71 5.38±0.62 5.64±0.34 5.49±0.51 5.52±0.46阴性转染组 7.41±0.92 6.83±0.89 6.25±1.02 6.48±0.84 5.83±0.76 5.65±0.77 5.76±0.68 5.74±0.79 miR-29b转染组 13.95±2.37† 24.44±3.85† 37.57±6.16† 28.17±8.15† 11.33±2.36† 21.16±4.49† 29.47±5.06† 18.69±3.18†HSC-T6组别

图5 HSC-T6、LX-2细胞抑制率比较 （±s）

2.6 miR-29b对HSC-T6、LX-2细胞中TGF-β1、SAMD3表达的影响

空白对照组、阴性转染组、miR-29b转染组HSC-T6细胞中TGF-β1、SAMD3蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=29.988和16.315，均P=0.0000）。空白对照组、阴性转染组、miR-29b转染组LX-2细胞中TGF-β1、SAMD3蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=44.951和50.643，均P=0.000）。见表4和图8。

图6 HSC-T6、LX-2细胞周期

图7 miR-29b对HSC-T6、LX-2细胞凋亡的影响

表4 HSC-T6、LX-2细胞中TGF-β1、SAMD3蛋白表达水平比较 （±s）

表4 HSC-T6、LX-2细胞中TGF-β1、SAMD3蛋白表达水平比较 （±s）

注：†与空白对照组、阴性对照组比较，P ＜0.05

组别HSC-T6 LX-2 TGF-β1 SAMD3 TGF-β1 SAMD3空白对照组 0.28±0.05 0.31±0.04 0.25±0.04 0.22±0.05阴性转染组 0.31±0.26 0.30±0.05 0.29±0.05 0.26±0.09 miR-29b转染组 0.82±0.05† 0.88±0.15† 0.78±0.09† 0.94±0.04†

空白对照组、阴性转染组、miR-29b转染组HSC-T6细 胞 中miR-29b、TGF-β1、SAMD3基 因相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=10.784、21.085和24.096，均P=0.000）。空白对照组、阴性转染组、miR-29b转染组LX-2细胞中miR-29b、TGF-β1、SAMD3基因相对表达量的比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=37.022，30.513和36.648，均P=0.000）。见表5和见图9。

图8 HSC-T6、LX-2细胞中TGF-β1、SAMD3蛋白表达水平比较 （±s）

表5 HSC-T6、LX-2细胞中miR-29b、TGF-β1、SAMD3基因表达水平比较 （±s）

表5 HSC-T6、LX-2细胞中miR-29b、TGF-β1、SAMD3基因表达水平比较 （±s）

注：†与空白对照组、阴性对照组比较，P ＜0.05

LX-2 miR-29b TGF-β1 SAMD3 miR-29b TGF-β1 SAMD3空白对照组 0.82±0.05 0.36±0.04 0.29±0.04 0.86±0.65 0.33±0.04 0.23±0.05阴性转染组 0.80±0.09 0.738±0.05 0.31±0.05 0.79±0.87 0.34±0.05 0.26±0.09 miR-29b转染组 0.42±0.05† 0.80±0.03† 0.79±0.15† 0.35±5.37† 0.78±0.09† 0.75±0.04†HSC-T6组别

图9 HSC-T6、LX-2细胞中miR-29b、TGF-β1、SAMD3基因表达水平比较 （±s）

3 讨论

肝纤维化主要由不同因子共同作用下破坏肝细胞外基质降解、分泌的平衡状态，导致细胞外基质逐渐沉积于肝细胞间造成肝脏损伤。引起肝纤化的因素较多，一般能够引起慢性肝病的因素均能导致肝纤化。研究显示，其病因主要包括感染性、代谢缺陷、化学毒性、免疫性肝病等方面[5]。近年来肝纤维化研究取得了较好的成果，较多临床研究证实肝硬化能够逆转，其中HSC在逆转过程中发挥重要作用，并且miRNA-29b也参与其中[6]。最新研究证实，在肝硬化恢复阶段激活后的HSC主要通过凋亡机制进行调节[7]。因此，了解肝纤维化的形成机制、HSC凋亡机制，以及与miRNA-29b的关系对肝纤维化临床治疗具有一定的参考意义。

miRNA属于内源非编码单恋分子，通过与靶基因mRNA上3’配对结合抑制mRNA的转录。最近研究发现，miRNA与肿瘤的发生、发展密切相关，参与肿瘤增殖、周期改变及迁移侵袭[8]。miR-29b基因属于microRNA一员，在胚胎组织中几乎不表达，在成熟组织细胞中广泛表达。较多研究显示，miR-29b在肺癌、卵巢癌等肿瘤组织中表达下调[9]。临床研究显示，与正常人相比，肝病患者血清miR-29b水平降低，且降低程度与病情严重程度呈正相关，表明miR-29b参与肝纤维化病程的发展[10]。体外研究显示，上调miR-29b能够促进胶原纤维生成，使星状细胞发生活化，加速胞外基质的生成[11]。国内外研究证实，TGF-β1/SAMDs通路参与肝纤维活化形成过程，TGF-β1与细胞膜受体结合后发生磷酸化，通过SAMD3等信号分子进入细胞核中，与转录因子结合进行基因调控[12-13]。动物研究发现，TGF-β1刺激HSC后miR-29b过表达，SAMD3受抑制表达量下降，说明miR-29b可能位于TGF-β1/SAMDs通路上游[14]。本研究为证实miR-29b在肝纤维化中的作用，通过HE染色发现肝组织随着模型复制时间的延长，纤维化比例逐渐升高，表明模型复制成功，大鼠肝脏组织逐渐形成纤维化，且组织病变特征符合肝纤维化病理特征。本研究结果显示在纤维化形成过程中，miR-29b基因表达水平逐渐降低，TGF-β1、SAMD3表达水平逐渐升高，推测抑制miR-29b的表达能够增强TGF-β1/SAMDs信号通路，进而促进肝纤维化，与国内学者研究结果相似[15]。

正常状态下，HSC为静止状态，当肝脏受到刺激后迅速激活HSC，数量迅速升高，生成大量纤维细胞，破坏细胞外基质合成、降解[16]。在肝纤维化恢复阶段，活化HSC数量明显降低，诱导HSC凋亡[17]。国外学者研究显示，miR-15b可以下调线粒体凋亡蛋白Bcl-2，上调Caspase-3，诱导HSC细胞凋亡[18]。细胞周期检测结果显示，miR-16能够抑制周期蛋白D1表达，使其在G1期增殖受阻滞，抑制细胞增殖，诱导凋亡[19]。体外研究结果显示，促纤维化细胞因子能够使HSC中miR-21上调，进而促进PTEN的表达，抑制HSC激活诱导其凋亡[20]。国外相关研究结果显示，miR-29b为肿瘤抑制因子，能够抑制肿瘤细胞增殖，诱导凋亡，同时抑制细胞侵袭能力[21]。国内研究报道，miR-29b能够通过抑制PTEN基因促进乳腺癌细胞迁移、凋亡[22]。本研究结果表明，转染miR-29b后 HSC-T6细胞增殖明显受到抑制，尤其在48 h时抑制最为明显。流式细胞仪检测结果显示，细胞在G1期增殖受到阻滞，G1期细胞数高于空白对照组、阴性转染组，而S期细胞数量降低。细胞流式仪检测结果显示，细胞凋亡率增加，提示转染miR-29b后能够抑制HSC-T6、LX-2细胞增殖，诱导HSC-T6、LX-2细胞早期凋亡，抑制肝纤维化。

本研究也存在一定的局限性，选取的模型时间较少，后期需要设置不同时间的模型组进一步验证，此外并未对肝纤维化大鼠进行给药治疗，以便探究miR-29b在肝纤维化恢复期的作用。总之，随着大鼠肝纤维化加重，miR-29b表达量逐渐降低，可抑制肝星状细胞增殖，诱导凋亡。