三溴丙酮酸对MCF-7细胞增殖、侵袭的影响及其机制研究*

李浩，戴世龙，赵宇，许博文，张青松

（1.河北省开滦总医院 普外科，河北 唐山 063000；2.华北理工大学 研究生学院，河北唐山 063210）

乳腺癌是常见的恶性肿瘤之一，部分患者确诊时肿瘤已浸润、转移，因此寻找有效的治疗中、晚期肿瘤的药物具有重要意义。三溴丙酮酸（3 bromopyruvate, 3-BrPA）是可促进凋亡或自噬的抗肿瘤新药[1-2]。目前，对其抑制肿瘤增殖及侵袭的机制知之甚少。真核转录起始因子5A2（eukaryotic translation initiation factor 5A2, eIF5A2）、c-myc基 因及转移相关蛋白1（metastasis-associated protein 1,MTA1）在肿瘤增殖、侵袭中起重要作用[3]。3-BrPA是否通过该途径发挥抗肿瘤作用，尚未见报道。本实验通过研究3-BrPA对eIF5A2、c-myc基因、MTA1表达的影响，探讨其抑制肿瘤增殖、侵袭的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株及仪器 乳腺癌MCF-7细胞株由华北理工大学中心实验室保存。

1.1.2 主要仪器 iMark酶标仪、Mini-Protean Tetra System、Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell购 自美国伯乐公司，QuantStudioTM6 Flex Real-Time PCR System（美国life公司），超速低温离心机（美国Sigma公司），Transwell小室（美国Costar公司）。

1.1.3 主要试剂 3-BrPA（大连美仑生物技术有限公司），MTT（美国Sigma公司），胎牛血清（澳大利亚Bovogen Biologicals公司），Matrigel基质胶（美国BD公司），eIF5A2、MTA1兔抗人单克隆抗体（美国Cell Signaling公司），c-myc兔抗人多克隆抗体（美国Epitomics公司），β-actin鼠抗人单克隆抗体（台湾Arigo公司）；逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）试剂盒、SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）试剂盒购自大连宝生生物技术有限公司，RT-PCR特异性引物（上海英潍捷基贸易有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组 乳腺癌MCF-7细胞在DMEM培养基（含10%胎牛血清和1%双抗），置于37℃、5%二氧化碳CO2恒温培养箱中常规培养，2 d或3 d换液1次。待长至80%～90%密度时，按1∶2传代培养。实验分为5组：加入等量PBS的对照组，75、100、125和150μmol/L 3-BrPA组（实验组）。

1.2.2 MTT法 利用MTT法检测细胞增殖情况。取对数生长期MCF-7细胞，将细胞按5×104个/孔接种于96孔板。细胞贴壁后，实验组加入等体积不同浓度的3-BrPA（以PBS稀释），对照组加入等体积PBS，每组6个复孔，常规培养24、48和72 h后加入MTT 15μl/孔，37℃孵育4 h，弃上清，加入二甲基亚砜 150μl/孔，摇床上震荡10 min，酶标仪检测490 nm处光密度值（optical density, OD值）。细胞存活率=实验组OD值/对照组OD值×100%，实验重复3次。

1.2.3 Transwell实验 依据Transwell实验，研究3-BrPA对MCF-7细胞侵袭的影响。在上室中均匀加入Matrigel胶，加入100μl以无血清培养基重悬的MCF-7细胞悬液，细胞数约2×104个/孔；下室加入含20% FBS的DMEM培养基600μl。细胞贴壁后，实验组分别加入等体积的75、100和150μmol/L 3-BrPA溶液，对照组加入等体积PBS，常规培养24 h后取出Transwell小室，PBS清洗2遍或3遍，4%多聚甲醛固定10 min，用棉签轻轻拭去室内未侵袭出的细胞，瑞士-吉姆萨染色10 min后PBS清洗3遍，每个小室随机取3个视野采集图像，实验重复3次。

1.2.4 RT-PCR 采用RT-PCR检测eIF5A2、c-myc及MTA1基因的表达。实验组MCF-7细胞以100μmol/L 3-BrPA处理24 h，对照组加入与药物等体积的PBS，提取细胞总RNA，纯度控制在1.8～2.1。按照RT-PCR试剂盒说明书进行操作。反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性5 s；60℃退火34 s，共40个循环。以2%琼脂糖凝胶电泳行荧光扩增产物验证。采用2-ΔΔCt法对结果进行分析，β-actin为内参，引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.2.5 Western blot检测 采用 Western blot检测eIF5A2、c-myc及MTA1蛋白的表达。用药物处理各组细胞24 h，BCA法定量提取蛋白，与5×上样缓冲液按4∶1的比例混合均匀后煮沸3～5 min备用。制胶、电泳、转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，4℃孵育一抗过夜。TBST漂洗3次，5 min/次，摇床上二抗孵育2 h，TBST漂洗3次，5 min/次。化学发光剂显影，内参选用β-actin，采用Image J软件分析图像灰度值，每组实验重复3次。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组比较用t检验，多组比较用方差分析，方差齐则两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3-BrPA对乳腺癌MCF-7细胞的生长抑制作用

24、48和72 h时，5组MCF-7细胞存活率比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。3-BrPA作用于乳腺癌MCF-7细胞后，细胞存活率降低，并具有剂量和时间依赖性。进一步两两比较经LSD-t检验，3-BrPA作用24 h时，75和100μmol/L 3-BrPA组细胞存活率与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；药物处理48 h时，各实验组较对照组细胞存活率降低（P＜0.05）；150与125μmol/L 3-BrPA组细胞存活率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；3-BrPA作用于细胞72 h时，各实验组较对照组细胞存活率降低（P＜0.05）；75和100μmol/L 3-BrPA作用于细胞后，其存活率随药物作用时间延长而降低（P＜0.05）。见表2和图1。

表2 各组不同时间点MCF-7细胞存活率比较 （%，±s）

表2 各组不同时间点MCF-7细胞存活率比较 （%，±s）

注：†与对照组比较，P ＜0.05

24 h 48 h 72 h对照组 100.00±0.00 100.00±0.00 100.00±0.00 75μmol/L 3-BrPA组 94.85±6.20 83.00±2.60† 74.58±5.75†100μmol/L 3-BrPA组 82.4±12.59 68.79±6.07† 59.62±12.6†125μmol/L 3-BrPA组 26.38±10.16† 20.75±7.72† 17.83±3.82†150μmol/L 3-BrPA组 16.43±2.91† 12.37±3.18† 12.78±3.50†F值 152.206 394.904 191.023 P值 0.000 0.000 0.000组别

图1 各组不同时间点MCF-7细胞存活率比较 （±s）

2.2 3-BrPA对MCF-7细胞侵袭的影响

MCF-7细胞经3-BrPA处理24 h时，对照组，以及75、100和150μmol/L 3-BrPA组细胞数分别为（281.67±18.77）、（159.00±24.06）、（76.33±9.07） 和（40.67±11.50）个，经方差分析，差异有统计学意义（F=119.894，P=0.000），各组穿过的细胞数不同。进一步两两比较经LSD-t检验，与对照组相比，各实验组细胞数降低，且具有剂量依赖性（P＜0.05）。见图2。

2.3 3-BrPA对eIF5A2、c-myc及MTA1基因表达的影响

RT-PCR结果表明，标准化对照组基因表达量为（1.000±0.000），则 100μmol/L 3-BrPA 组eIF5A2、c-myc及MTA1基因的相对表达量分别为（0.764±0.088）、（0.735±0.144）和（0.606±0.095）。100μmol/L 3-BrPA作用24 h时的eIF5A2、c-myc及MTA1基因表达水平与对照组比较，差异有统计学意义（t=4.664、3.186和7.170，P=0.010、0.033 和 0.019），100μmol/L 3-BrPA组较对照组降低。见图3。

2.4 3-BrPA对eIF5A2、c-myc及MTA1蛋白表达的影响

MCF-7细胞经3-BrPA处理24 h后，75和100μmol/L 3-BrPA组、对照组eIF5A2、c-myc及MTA1蛋白表达水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05），75和 100μmol/L 3-BrPA 组较对照组降低。进一步两两比较经LSD-t检验，75μmol/L 3-BrPA组eIF5A2蛋白表达水平与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；100μmol/L 3-BrPA组eIF5A2蛋白表达水平较对照组降低（P＜0.05）；与对照组相比，c-myc和MTA1蛋白表达量经3-BrPA处理后均降低，且具有浓度依赖性（P＜0.05），其中MTA1蛋白降低更明显。见表3和图4。

图2 3-BrPA作用24 h时各组MCF-7细胞侵袭情况 （×200）

图3 对照组与100μmol/L 3-BrPA组eIF5A2、c-myc及MTA1基因相对表达量比较 （±s）

表3 各组eIF5A2、c-myc及MTA1蛋白表达水平比较 （±s）

表3 各组eIF5A2、c-myc及MTA1蛋白表达水平比较 （±s）

注：†与对照组比较，P ＜0.05

eIF5A2 c-myc MTA1对照组 0.971±0.102 1.029±0.112 1.549±0.045 75μmol/L 3-BrPA组 0.821±0.057 0.687±0.057† 1.049±0.125†100μmol/L 3-BrPA组 0.628±0.083† 0.516±0.069† 0.368±0.044†F值 12.976 29.749 160.834 P值 0.007 0.001 0.000组别

图4 各组eIF5A2、c-myc及MTA1蛋白的表达 （±s）

3 讨论

乳腺癌发病率居女性肿瘤之首，且近10年仍有上升趋势[4]。部分患者被确诊为乳腺癌时，已发生浸润及远处转移，此时化疗具有重要意义。3-BrPA是近年发现的一种新型有效的抗肿瘤药物，目前处于研究阶段，尚未进入临床应用。以往的研究主要集中在对肿瘤糖代谢及凋亡方面的研究[5]，关于其抑制肿瘤增殖及侵袭的机制知之甚少。

eIF5A2在胃腺癌、卵巢癌、结肠癌、非小细胞性肺癌及食管癌等实体肿瘤中均有过表达[6]。eIF5A2过表达与患者生存期的缩短呈正相关，并且会增加肿瘤的侵袭及转移，促进肿瘤上皮间质转化。降低eIF5A2基因的表达，肿瘤的侵袭、转移及上皮间质转化受到抑制。有研究表明，eIF5A2可通过c-myc调节MTA1的表达，来降低肿瘤侵袭和转移的能力[7-8]。有研究表明，eIF5A2-c-myc/MTA1轴在肿瘤的上皮间质转化、增殖、迁移及侵袭中可能起重要作用[3]。MTA1为eIF5A2的下游靶点，下调MTA1的表达后，胰腺癌SW1900细胞的增殖、迁移及侵袭作用受抑制，细胞凋亡率增加[9]。MENG等[10]研究提示，下调eIF5A2基因以降低CyclinD1、CyclinD3的表达，可抑制胰腺癌MKN28细胞的增殖；亦可通过eIF5A2抑制c-myc、MTA1的表达及上皮间质转化途径，降低其侵袭和迁移能力。XU等[11]通过miR-9靶向作用于非小细胞肺癌细胞eIF5A2基因后，细胞上皮间充质转化受抑制，增殖和迁移能力也降低。MENG等[8]通过siRNA抑制eIF5A2基因，可明显抑制胃癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力。

有研究表明，3-BrPA可以抑制MCF-7细胞增殖，使细胞周期阻滞在S期及G2/M期，并促进其凋亡，该过程可能与降低Bcl-2、c-myc及突变型P53的表达有关[12]。依据MTT和Transwell结果，3-BrAP作用于乳腺癌MCF-7细胞，其增殖和侵袭能力降低；RTPCR和Western blot结果表明，3-BrPA作用于乳腺癌MCF-7细胞24 h，eIF5A2、c-myc、MTA1基因和蛋白表达水平降低，其中MTA1基因和蛋白降低更为明显。

综上所述，3-BrPA可以抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖和侵袭，其机制可能与降低eIF5A2、c-myc、MTA1基因和蛋白的表达有关，但具体作用机制有待进一步深入研究。目前，3-BrPA尚处于临床前研究阶段，细胞实验和动物体内实验效果均比较理想。由于3-BrPA在溶剂中的化学性质不稳定，见光易分解。因此，解决药物成药问题是其进入临床应用的关键，也是下一步的研究重点。