肝细胞癌中SETDB1的表达及其对肿瘤生长的影响

（西南医科大学附属医院 肝胆外科，四川 泸州 646099）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是我国最常见的消化系统恶性肿瘤之一[1-2]。编码基因位于人类染色体1q21上的SET结构域分支型1（SET domain bifurcated 1, SETDB1）是一种组蛋白赖氨酸N端甲基转移酶[3-5]。有研究显示，前列腺癌及非小细胞肺癌中高表达的SETDB1对肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭具有促进作用，并且能对患者预后进行评价[6-7]。本研究检测HCC中SETDB1的表达，通过敲除SETDB1研究其对肝癌细胞体内外增殖凋亡能力的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 临床资料 选取2014年1月-2016年3月于西南医科大学附属医院肝胆外科行手术切除的50例HCC患者的组织标本及35例因肝外伤或肝血管瘤而切除患者的正常肝组织标本。所有标本于离体30 min内取材，于中性甲醛溶液中保存、固定。

1.1.2 细胞来源及主要试剂 肝癌MHCC97H细胞购自上海细胞库，并由本科实验室保存。SETDB1特异性shRNA慢病毒颗粒（病毒载体类型：psi-LVRH1GP）购自广州复能基因公司，DMEM（11965-084）、胎牛血清（16000044）购自美国Gibco公司，Annexin V凋亡检测试剂盒（FITC/PI双染法,E606336）购自上海生工生物工程有限公司，Trizol试 剂（15596026）、RT-PCR试剂盒（SuperScript®One-Step RT-PCR System with Platinum® Taq DNA Polymerase, 10928042） 及qPCR试剂盒（DyNAmo Flash SYBR Green qPCR Kit, F415L）购自美国Invitrogen公司，兔抗人SETDB1单克隆抗体（#2196）、兔抗人组蛋白H3单克隆抗体（#9717）、兔抗人H3K9me3单克隆抗体（#13969）、兔抗人p53单克隆抗体（#2527）及兔抗人β-actin单克隆抗体（#4970）购自美国CST公司；兔SP免疫组织化学试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司。

1.2 免疫组织化学染色

将石蜡包埋的标本组织切片常规进行脱蜡及水化预处理；用抗体稀释液按1∶100比例稀释兔抗人SETDB1多克隆抗体，滴加抗体于组织切片上并充分浸没组织标本。4℃恒温冰箱内孵育过夜，洗净未结合一抗后，使用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗结合相应一抗，DAB法显示阳性蛋白。每张组织切片在400倍视野下随机选取10个视野进行阅片。＞10%癌细胞胞核呈棕黄色或棕褐色染色即为阳性，否则判定为阴性。

1.3 细胞培养及慢病毒感染

MHCC97H细胞于适宜环境中培养，稳定传2代或3代后进行实验。将MHCC97H细胞按过夜增殖至愈合度达70%的密度接种于6孔细胞培养板。达到预定培养密度后移除培养基，磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline, PBS）充分洗涤细胞。慢病毒感染分组：每孔加入1 ml sh-SETDB1慢病毒上清液、2 ml完全培养基及15μg Ploybrene作为sh-SETDB1组；每孔加入1 ml sh-Control慢病毒上清液、2 ml完全培养基及15μg Ploybrene作为sh-Control组。转染48 h后，使用含2μg/ml Puromycin的完全培养液筛选稳定转染细胞株。

1.4 qRT-PCR

通过Trizol试剂提取标本及细胞RNA，配制逆转录及PCR扩增体系。逆转录条件：50℃预变性30 min，94℃变性2 min，循环1次后94℃变性15 s，60℃退火30 s，68℃延伸3 min，循环40次后72℃继续延伸10 min。通过2-△△Ct法计算SETDB1基因的相对含量。

1.5 Western blot检测

采用RIPA试剂提取细胞总蛋白，凝胶垂直电泳分离蛋白，70 V恒压转膜150 min，5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）室温封闭1 h；用3%浓度的脱脂奶粉溶液按1∶1 000比例稀释SETDB1、H3K9me3、p53及β-actin抗体。在4℃下孵育相应条带过夜。洗去残余一抗后采用1∶5 000稀释的辣根过氧化物酶标记山羊抗兔或抗鼠二抗室温孵育条带1 h。于暗室内，增强化学发光法观察蛋白表达。每个样本独立重复实验3次。

1.6 平板克隆形成试验

将MHCC97H细胞按500个/孔均匀接种于6孔板中，更换完全培养基2次/周。培养2周后，使用4%多聚甲醛固定细胞30 min，1%结晶紫染色15 min，置于蒸馏水中洗去多余染液。风干后将6孔板置于网格纸上统计每孔克隆形成数量，计算克隆形成率。每个样本独立重复实验3次。

1.7 流式细胞术

将MHCC97-H细胞用预冷PBS工作液冲洗2次，胰酶消化细胞后1 500 r/min离心5 min沉淀细胞，预制缓冲液调整细胞数为1×106个/ml，将500μl细胞悬液与5μl Annexin V-FITC及10μl PI混合，室温遮光反应10 min后上机测试。

1.8 裸鼠皮下移植瘤模型的复制

6只5周龄BLAB/c裸鼠，随机分为sh-SETDB1组和sh-Control组，每组3只，分组后各组适应性饲养1周。分别取对数生长期的sh-SETDB1和sh-Control细胞，以冷PBS溶液制成细胞悬液，调整细胞终浓度为2.0×107个/ml。使用1 ml注射器，将0.2 ml细胞悬液（约含4.0×106个细胞）接种于裸鼠背部近右下肢处皮下组织内，复制裸鼠皮下移植瘤模型。裸鼠饲养4周，每周测量肿瘤长度及宽度，按（长轴×短轴2）/2来计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。

1.9 统计学方法

数据分析采用SPSS 13.0统计学软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验或单因素方差分析，计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SETDB1蛋白在HCC和正常肝组织中的阳性表达

免疫组织化学染色发现，SETDB1位于细胞核。50例HCC组织中SETDB1蛋白的阳性表达率为80.00%（40/50），35例正常肝组织中SETDB1蛋白的阳性表达率为31.43%（11/35），经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=20.238，P=0.000）。见图1。

图1 SETDB1在HCC和正常肝组织中的表达

2.2 不同影响因素下的SETDB1阳性表达

HCC组织中不同直径肿瘤比较，差异有统计学意义（P＜0.05），SETDB1阳性表达与肿瘤体积增大关系密切。见表1。

表1 不同影响因素下的SETDB1阳性表达率比较

2.3 沉默SETDB1表达对MHCC97H细胞增殖、凋亡的影响

sh-Control组SETDB1 mRNA相对表达量为（1.00±0.00），sh-SETDB1组 为（0.38±0.11）， 经t检验，差异有统计学意义（t=5.219，P=0.017）。sh-Control组SETDB1蛋白相对表达量为（0.46±0.08），sh-SETDB1组为（0.17±0.02），经t检验，差异有统计学意义（t=3.071，P=0.036）。sh-SETDB1组抑制MHCC97H细胞克隆率为（81.34±10.29）%，sh-Control组为（53.22±8.31）%，经t检验，差异有统计 学 意 义（t=4.025，P=0.029）。sh-SETDB1组 促进MHCC97H细胞凋亡率为（31.45±6.19）%，sh-Control组为（18.08±5.33）%，经t检验，差异有统计学意义（t=3.740，P=0.031）。见图 2。

图2 沉默SETDB1表达对MHCC97H细胞增殖、凋亡的影响

2.4 沉默SETDB1表达对裸鼠皮下移植瘤生长的影响

sh-SETDB1组MHCC97H细胞在裸鼠体内的生长速度为（0.010±0.004）cm3/d，sh-Control组为（0.050±0.010）cm3/d，经t检验，差异有统计学意义（t=23.605，P=0.039）。饲养4周后处死动物获取皮下肿瘤，sh-SETDB1组最终肿瘤体积为（1.34±0.31）cm3，sh-Control组为（0.41±0.12）cm3，经t检验，差异有统计学意义（t=3.581，P=0.031）。见图3。

2.5 沉默SETDB1表达对MHCC97H细胞中H3K9me3和p53表达的影响

sh-Control组MHCC97H细胞中H3K9me3的表达水平为（0.73±0.09），sh-SETDB1组为（0.13±0.02），经t检验，差异有统计学意义（t=4.427，P=0.025）sh-Control组 p53的表达水平为（0.67±0.06），sh-SETDB1组 为（0.21±0.04）， 经t检 验， 差异有统计学意义（t=3.060，P=0.041），sh-Control组H3的表达水平为（0.42±0.03），sh-SETDB1组为（0.39±0.02），两组比较，差异无统计学意义（t=1.036，P=0.205）。SETDB1并未调控组蛋白H3的表达，而是通过调控组蛋白H3甲基化抑制p53的表达,促进肿瘤细胞增殖。见图4。

图3 沉默SETDB1表达对MHCC97H细胞移植瘤生长的影响

图4 沉默SETDB1表达对MHCC97H细胞内H3K9me3和p53表达的影响

3 讨论

SETDB1作为一种蛋白甲基化转移酶，实验证据表明其能与异染色质蛋白1及其共抑制子KAP1在异染色质中结合而促进H3K9me3形成[8-9]。本研究的免疫组织化学染色结果显示，50例HCC组织中SETDB1的阳性表达率要高于35例正常肝组织，并且高表达SETDB1的患者肿瘤体积增大。说明在临床上检测肝癌组织中SETDB1的表达对判断患者肿瘤进展有一定参考价值。

目前，虽然在许多肿瘤中都发现了SETDB1的异常表达，但是其具体的生物学功能尚不完全清楚[10]。在非小细胞肺癌中，SETDB1通过正向激活WNT-βcatenin信号通路来促进HCC细胞增殖，相似的生物学作用也存在于脑胶质母细胞瘤中[11-12]。但是WU等[13]的研究结果却指出，SETDB1能与SMAD2和SMAD3形成SETDB1/SMAD2/3抑制性复合体来抑制TGF-β诱导的肺癌细胞转移。在本研究中，笔者通过细胞增殖及凋亡实验表明，体外沉默SETDB1的表达致使肝癌MHCC97H细胞的增殖能力受到抑制。除此之外，动物肿瘤生长模型也指明，下调SETDB1的表达能够抑制MHCC97H细胞在体内的生长。综合上述结果表明，下调SETDB1的表达是抑制肝癌生长的有效手段之一。SETDB1能够特异性甲基化组蛋白H3的K9位点，形成甲基化的组蛋白H3K9me3。有研究指出，H3K9me3的形成与包括p53在内的许多抑制肿瘤细胞生长的基因失活有关[14]。在本研究中，笔者在沉默SETDB1表达后发现H3K9me3的表达水平降低，而p53的表达水平升高，提示SETDB1促肿瘤生长可能与抑制p53的表达有关。另外，p53在肺癌中还可能作为一种转录抑制因子结合在SETDB1的启动子区域，抑制其转录过程[15]。说明p53与SETDB1存在复杂的相互制约关系。在HCC中p53的失活是一种普遍现象，这也部分揭示了SETDB1在HCC中高表达的原因[16]。

综上所述，SETDB1是HCC中高表达的促癌分子，沉默SETDB1的表达可能通过恢复p53的表达而抑制HCC增殖并促进其凋亡。