瑶药黄稔根不同极性部位对LPS诱导RAW264.7细胞炎症的保护作用△

龚 雪 韩奇亨 任 凯 张国俊 张春红 李旻辉,2,3,4,5*

(1.包头医学院，内蒙古 包头 014060；2.广西药用植物园广西药用资源保护与遗传改良重点实验室，广西 南宁 530023；3. 内蒙古自治区中医药研究所，内蒙古 呼和浩特 010110；4. 内蒙古自治区特色药用植物培育与保护工程技术研究中心，内蒙古 包头 014060；5. 内蒙古自治区特色道地药材资源保护与利用重点实验室，内蒙古 包头 014060)

黄稔根为野牡丹科酸脚杆属植物北酸脚杆Medinilla septentrionalis(W.W.Sm.)H. L. Li的干燥全株，瑶药名为红节风，黄稔根生于山谷、山坡密林中或林缘阳湿处，分布于广东、广西、云南等地。收载于《中华本草》和《广西壮族自治区瑶药材质量标准》(第一卷)，黄稔根味苦、酸，性平。归肝、大肠经，瑶药中属风打相兼药。具有清热解毒、止血凉血、消肿止痛之功效，用于小儿惊风、热感冒、尿淋、尿血、月经不调、牙龈出血、牙周炎[1-4]。基于此，本研究以脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7而构建的炎症细胞模型为研究对象，采用黄稔根不同极性部位(石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位)处理炎症模型，对黄稔根4个不同极性部位进行活性筛选，探讨黄稔根不同极性部位对细胞的安全性及抗炎效果，为黄稔根的抗炎机制作用研究奠定基础，为指导临床安全用药和扩大其开发利用范围提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞，购自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库。

1.1.2 药品与试剂 黄稔根采于广西壮族自治区上林县大明山，经广西药用植物园韦坤华副研究员鉴定为野牡丹科植物北酸脚杆。药材干燥全株经粉碎成中细粉(过四号筛)，采用乙醇提取法，以70 %乙醇加热回流提取3次，合并提取液浓缩至干，残渣加水溶解，分别以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，将各自萃取液浓缩至干，即得石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水4个极性部位。实验前用DMSO配成200 mg/mL的母液，再用培养基稀释至所需质量浓度；DMEM高糖培养基(Gibco公司)；四季青胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS，Sigma公司)；DMSO和青霉素、链霉素(海克隆生物化学制品(北京)有限公司)；噻唑蓝(MTT，sigma公司)。

1.1.3 仪器 Thermo 311 CO2培养箱(Thermo公司)，SW-CJ超净台(上海新苗医疗器械制造有限公司)，XDS-1B倒置显微镜(上海比目仪器厂)，Thermo Scientific Multiskan FC酶标仪(Thermo公司)，台式离心机(Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 小鼠单核巨噬细胞RAW264.7用含10 %胎牛血清，100 mg/L青霉素，100 mg/L链霉素的DMEM培养液于37 ℃、5% CO2培养箱中培养[5]。取对数生长期细胞用于后续实验。

1.2.2 黄稔根不同极性部位对RAW264.7细胞增殖的影响 RAW264.7细胞按1×105 个/mL接种于96孔细胞培养板中，待细胞贴壁后，分别加入系列浓度( 12.5、25、50、100、200 μg/mL) 的黄稔根不同极性部位。同时设空白对照(未加黄稔根不同极性部位)，每组设置5个平行孔，培养24 h后，每孔加入新配制的5 mg/mL MTT溶液10 μL，37 ℃避光孵育4 h，终止培养。吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min后，用酶标仪测量各孔的吸光度值(OD 570 nm)，根据公式：细胞存活率 = (药物孔OD值-本底对照孔OD值) /(对照细胞孔OD值-本底对照孔OD值)×100 %计算细胞存活率[6]。

1.2.3 黄稔根不同极性部位对LPS诱导RAW264.7细胞炎症的保护作用 取对数生长期RAW264.7细胞按1×105 个/mL接种于96孔细胞培养板中，待细胞贴壁后，分别加入不同浓度(12.5、25、50、100、200 μg/mL) 的黄稔根不同极性部位，保护4 h后加入终浓度为1μg/mL的LPS。设空白对照组、LPS组，LPS组+黄稔根不同极性部位组，每组设置5个平行孔，培养20 h后，每孔加入新配制的5 mg/mL MTT溶液10 μL，37 ℃避光孵育4 h，终止培养。吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min后，用酶标仪测量各孔的吸光度值( OD 570 nm)并计算细胞存活率。

2 结果

2.1 黄稔根不同极性部位对RAW264.7细胞增殖的影响 采用MTT法检测黄稔根不同极性部位对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞增殖活性的影响。结果显示，与空白组比较，黄稔根不同极性部位系列浓度(25、50、100、200 μg/mL)对RAW264.7细胞的增殖作用无显著性差异(P> 0.05)。实验结果表明，在实验浓度范围内黄稔根的不同极性部位对细胞增殖无影响，无细胞毒性作用(图1)。

2.2 黄稔根不同极性部位对LPS诱导RAW264.7细胞炎症的保护作用 与LPS模型组比较，浓度为50、100、200 μg/mL黄稔根乙酸乙酯部位(图2-b)和正丁醇部位(图2-c)能显著改善LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7的炎症反应，具有较好的浓度依赖性(P< 0.05)，表明乙酸乙酯和正丁醇部位在较高浓度下具有较好的保护活性。而相同浓度的黄稔根石油醚部位(图2-a)与LPS模型组相比仅在200 μg/mL浓度下有保护性作用，而在其它浓度下无保护性作用(P>0.05)。不同浓度的黄稔根水部位(图2-d)并未表现出保护作用，无保护活性。

3 讨论

我国是一个多民族的国家，自古以来，各少数民族在与疾病斗争中，形成了各具特色的传统医药。黄稔根虽然为瑶医常用药，但对其药理研究却甚少。为此，本实验对黄稔根对细胞的安全性及其抗炎活性进行初步探讨。结果显示黄稔根不同极性部位对小鼠巨噬细胞RAW264.7无细胞毒性。通过LPS诱导RAW264.7构建炎症细胞模型分析黄稔根石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水部位的保护性作用。研究结果发现黄稔根乙酸乙酯部位和正丁醇部位能显著改善LPS诱导RAW264.7细胞的炎症反应且呈现出较好的浓度依赖性。上述研究结果初步证明黄稔根对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症具有保护作用，该结果可为进一步阐明其抗炎机制奠定基础。另外，针对黄稔根乙酸乙酯及正丁醇活性部位还需利用现代化学等技术手段进行进一步的分离和分析以确定活性单体化合物。同时，黄稔根对RAW264.7细胞炎症是基于哪些信号通路来发挥抗炎作用的也需要更深一步的研究。