牦牛病毒性腹泻病诊断与病毒分离鉴定
2018-11-19樊凤霞骆正杰
樊凤霞，骆正杰
（1.青海省大通种牛场，西宁 810102；2.国家肉牛体系大通综合试验站，西宁 810102）
0 引言
牛病毒性腹泻是由牛病毒性腹泻病毒感染而引起的一种以腹泻、繁殖障碍及免疫障碍为主要临床特征的急性、热性、高度接触性、传染性疾病。由于牛病毒性腹泻会严重影响牛的机体免疫功能，造成牛出现免疫抑制和持续性感染，导致机体免疫力下降，对养殖业造成巨大经济损失。
1 材料与方法
1.1 试验材料
病毒分离鉴定主要选择由大通回族自治县实验室保存的牦牛肾传代细胞，牛病毒性腹泻病毒阳性血清、阴性血清、牛病毒性腹泻间接免疫荧光检测试剂盒3种物品均购自于中国兽医药品监察所。
1.2 临床诊断
结合大通县某养殖场的实际发病情况，对该养殖场发病牛的临床症状进行认真仔细地观察，结合养殖场该病的流行情况和患病牛的临床表现，对该病做出初步诊断。
1.3 试验方法
1.3.1 样品采集
采集养殖场某患病牛的鼻腔粘液和粪便，作为临床实验室诊断病料，低温保存带回实验室。
1.3.2 病毒分离培养与细胞病变观察
将从患病养殖场带回的鼻腔粘液和粪便分别用经过灭菌的生理盐水充分进行5倍稀释，使用0.45 um的滤膜进行充分过滤后，除去表面细菌，取0.5 mL滤液接种到牛肾传代单层细胞中，在5%的二氧化碳培养箱内37 ℃培养，每天观察细胞的病变情况，连续培养第5天后，收获病毒，盲传10代。
1.3.3 病毒毒价测定
将盲传10代后分离得到的毒株分别进行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8倍稀释，将各稀释病毒分别接种到96种细胞培养板培养的牛肾传代单层细胞中，每个孔接种0.1 mL，每个稀释度分别接种8个孔，连续培养5 d后，根据各个稀释度细胞病变孔数计算分离得到的病毒对牛肾传代细胞的半数感染量。
1.3.4 病毒中和试验
将盲传10代分离得到的病毒与等量体积的牛病毒性腹泻标准阳性血清和标准阴性血清在室温环境下中和1 h后，分别接种到牛肾传代单层细胞中，将细胞放置于5%的二氧化碳培养箱内37 ℃恒温培养5 d，每天观察细胞的病变情况，观察分离得到的病毒分别与阳性血清、阴性血清中和作用后是否能引起细胞发生特异性病变，确定阳性血清和阴性血清是否对分离得到的病毒具有中和作用。
1.3.5 间接免疫荧光试验
将盲传10代分离得到的病毒接种到牛肾传代单层细胞中，并按照牛病毒性腹泻间接免疫荧光检测试剂盒的说明书严格操作，确保整个操作正确[1]。
2 临床诊断与试验结果
2.1 临床诊断
青海省大通回族自治县某养殖场，共饲养牦牛100余头，2017年4月13日，养殖场中的2头2月龄犊牛，突然出现发病状况，发病初期表现为体温突然升高到42 ℃以上，精神萎靡不振，采食停止，随后从鼻腔和眼睛中分泌出浆液性和脓性内容物，鼻镜糜烂，检查口腔黏膜存在溃疡病变，从口腔中呼出恶臭气体。随后出现水样腹泻症状，开始时粪便中会夹杂大量粘液和小气泡，发病中后期粪便中夹杂大量血液和肠粘膜脱落物，身体逐渐消瘦，病程持续3～4周。在整个发病期间，尝试使用多种抗生素结合治疗，均未取得明显效果，根据临床症状，初步怀疑是牛病毒性腹泻[2]。
2.2 病毒分离培养与细胞病变观察
将采集到的病料妥善处理接种到牛肾传代单层细胞中后，盲传到第7代，开始陆续出现病变明显的细胞，主要表现为接种毒株后72 h内，细胞逐渐萎缩，拉网聚集脱落。病毒盲传到第10代后，收获病毒，－80 ℃环境保存。
2.3 分离毒株毒价鉴定
将盲传到第10代获得的毒株按照上述要求进行充分稀释后，将各个稀释度分别接种到96孔细胞培养板培养的牛肾传代单层细胞中，细胞病变情况如表1所示。按照Reed-Muench法计算毒株的毒价为10-5.19/0.1 mL。
表1 分离毒株毒价鉴定记录
2.4 病毒中和试验
盲传到第10代获得的毒株和牛病毒性腹泻阳性血清作用后接种的牛肾传代单层细胞未出现任何细胞病变情况，与牛病毒性腹泻阴性血清作用后接种的牛肾传代单层细胞，细胞逐步出现萎缩、拉网、聚集、脱落等典型的细胞病变。因此，可以确定牛病毒性腹泻阳性血清对分离得到的病毒的增殖具有明显的中和作用。
2.5 荧光免疫试验
盲传到第10代获得的毒株的牛肾传代单层细胞浆内出现了明显的特异性绿色荧光病变，而正常的细胞细胞浆内不会出现任何特异性绿色荧光变化。因此，可以确诊分离的病毒为牛病毒性腹泻病毒[3]。
3 结论
牛病毒性腹泻病毒在临床和病理变化上与牛冠状病毒、轮状病毒较为相似。结合患病牛流行病学特点、临床症状和病理学变化，可以对病情做出初步诊断，但要进一步确诊，还需要借助实验室诊断方法明确病原。经过实验室诊断和临床诊断最终确诊为牛病毒性腹泻病毒感染。通过采集发病养殖场患病牛的新鲜病料，带回实验室后接种到牛肾传代单层细胞中，盲传10代后分离得到了牛病毒性腹泻病毒。
在进行病毒检测中，病毒中和试验一直是应用较为广泛的检测方法。间接免疫荧光试验法是现行兽医典中规定的兽用生物制品检测牛病毒性腹泻病毒外源感染的主要方法。随着我国科学技术不断发展，用于检测该种病毒的试剂盒已经存在，并且已经成熟应用。试剂盒检测牛病毒性腹泻具有操作简单、检测速度快、干扰小的特点，能快速鉴定牛病毒性腹泻病毒。因此，此次研究主要采用综合试验和间接免疫荧光试验的方法对病毒进行鉴定，结果可靠稳定。通过分离养殖场的致病原，明确致病原类型，为该养殖场今后疾病的防控提供有效参考。
