HPLC法测定板蓝根中抗病毒化学物质组的含量*

★ 肖雪 马晋芳 罗国安（1.广东药科大学中医药研究院 广州 510006；2.清华大学化学系 北京 100084；3.中山大学南沙研究院 广州 511458；4.中山大学药学院 广州 510006）

板蓝根（Isatidis Radix）为十字花科植物菘蓝（Isatis tinctoriaL.）的根，具有清热解毒、凉血利咽的功效，主要用于温热病发热、头痛、喉痛，或温毒发斑、痄腮、痈肿疮毒、丹毒、大头瘟疫等多种热毒炽盛之证［1-2］。在近十年中，板蓝根在抗击非典、甲流等传染病中发挥了重要的作用［3-5］。虽然板蓝根在临床中应用广泛，但是板蓝根抗病毒成分的质量控制指标不完善［6-8］，《中国药典》（2015年版）仅规定了（R，S）-告依春作为板蓝根水溶性成分的含量测定项。本试验拟从化学物质组学［9］的角度，开展不同产地板蓝根中抗病毒化学物质组的含量测定研究，在既往的研究基础［10］上，采用HPLC法同时测定板蓝根中文献中报道的抗病毒化学物质组-尿苷、腺苷、鸟苷和（R，S）-告依春的含量。本研究可为不同产区板蓝根质量评估提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1200 series LC液相色谱系统（包括：二元梯度泵、二极管阵列检测器、柱温箱、Chemstation化学工作站等）（美国Agilent公司）；XS105型电子天平（d=0.01mg，梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司）；SL300N型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；RUG-5200型超声波清洗器（上海锐祺电子设备有限公司）；XJD-250B型微型高速粉碎机（姜堰市银河仪器厂）；Milli-Q超纯水仪（默克密理博公司）。

1.2 材料 尿苷（批号110887-200202）、腺苷（批号110879-200202）、（R，S）-告依春（批号111753-201304）对照品购于中国药品生物制品检定院；鸟苷（批号1309326-61607015）标准品采购于Sigma公司；甲醇、乙腈（色谱纯，德国默克公司），甲酸、乙醇等为分析纯（天津市大茂化学试剂厂）。

板蓝根药材，产地分别为河南（HN）、河北（HB）、东北（DB）、甘肃（GS）、甘肃河西（HX）、甘肃武威（WW）、安徽（AH）、黑龙江（HLJ），由广州白云山明兴制药有限公司提供，经该公司陈文荣高级工程师鉴定为十字花科植物菘蓝（Isatis tinctoriaL.）的根。

2 方法与结果

2.1 色 谱 条 件［9］色 谱 柱：Phenomenex C18柱（4.60mm×250mm，5μm），流动相条件：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）；梯度洗脱：0～12%B（0～42min），12%～19%B（42～65min）；流速：0.5mL/min，检测波长254nm、240nm，柱温25℃，进样量：10μL。

2.2 混合对照品溶液的制备 精密称取尿苷对照品4.42mg，腺苷对照品4.93mg，鸟苷对照品4.84mg，（R，S）-告依春对照品3.54mg，分别置10mL容量瓶中量瓶中，用10%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为混合标准品溶液。将混合标准品溶液各取适量置于10mL量瓶中，加入10%甲醇溶液至刻度，摇匀配制成一系列不同浓度的混合标准品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 精密称取板蓝根粉末（过3号筛）约0.5g，精密加入10%甲醇50mL，称定重量，超声处理（功率300W，频率50KHz）10min后，再回流提取50min，放冷，用10%甲醇补足缺失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 空白干扰试验 取供试液、尿苷、腺苷、鸟苷、（R，S）-告依春的混合对照液和缺板蓝根的空白液，各进样10μL。结果表明尿苷、腺苷、鸟苷、（R，S）-告依春对照液和供试品溶液均呈现吸收峰，而空白液在与对照品相应的位置上没有色谱峰出现，如图1所示，表明本测定无干扰。

图1 板蓝根标准品溶液色谱图（A）与空白对照图（B）

2.5 线性关系考察 精密吸取上述混合对照品溶液，分别进样10μL，注入高效液相色谱仪，测定峰面积积分值。以尿苷、腺苷、鸟苷、（R，S）-告依春对照品浓度（µg/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，尿苷、腺苷、鸟苷、（R，S）-告依春的回归方程分别为：Y=29923X+25300，R2=0.9997；Y=44814X+116966，R2=0.9996；Y=56713X+74922，R2=0.9998；Y=131480X+72635，R2=0.9999。尿苷、腺苷、鸟苷、（R，S）-告依春分别在 4.416～441.6µg/mL、4.848～484.8µg/mL、4.928～492.8µg/mL、3.356～353.6µg/mL 范 围 内 线性关系良好。

2.6 精密度试验 取同一对照品连续进样6次，结果尿苷、腺苷、鸟苷、（R，S）-告依春含量的RSD（%）依次为0.96、0.84、0.84、0.65，说明本方法精密度良好。

2.7 重复性试验 取板蓝根药材按照药材供试品制备方法平行制备供试品6份，结果尿苷、腺苷、鸟苷、（R，S）-告依春含量的RSD（%）依次为2.8、2.4、1.1、1.1，说明本方法重复性良好。

2.8 稳定性试验 按照供试品溶液制备方法制备一份供试品，分别在0、2、4、6、8、12、24h进样，结果尿苷、腺苷、鸟苷、（R，S）-告依春含量的RSD（%）依次为1.1、0.84、0.93、1.1，说明供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.9 加样回收率试验 精密称取已知含量的同一组板蓝根药材，加入各成分对照品适量，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下方法进行分析。结果显示，尿苷、腺苷、鸟苷、（R，S）-告依春的平均加样回收率分别为99.64%、98.85%、98.94%和100.10%。结果如表1。

2.10 样品测定 按照供试品溶液的制备方法制备8个产地板蓝根样品，按照上述色谱条件测定，计算含量，色谱图如图2，结果见表2。

表1 加样回收率考察结果

图2 各产地板蓝根药材HPLC图（A：HN，B：HB：C：DB，D：GS；E：HX；F：WW；G：AH，H：HLJ；1.尿苷，2.腺苷，3.鸟苷，4.（R，S）-告依春）

表2 各产地板蓝根药材抗病毒成分含量 µg/mL

3 讨论

3.1 提取方法的选择 有文献报道按照药典方法，通过水提醇沉工艺来考察板蓝根中核苷类成分的含量［11］，此方法容易产生误差，结合文献［12］本文通过加约100倍量10%甲醇溶液在超声处理后，再进行回流提取，操作简单易行。

3.2 流动相的选择 已有文献报道用HPLC法测板蓝根药材及其制剂中尿苷、鸟苷、腺苷、（R，S）-告依春中一个或多个成分的含量［12-15］。本试验在文献［10］研究的基础上所选择的0.1%甲酸水和乙腈为流动相，梯度洗脱的色谱条件，可用于板蓝根的药材、饮片制备、制剂等相关产品生产过程的质量控制。

3.3 化学物质组学研究 化学物质组学是指一定条件下输入生物体系的所有化学物质（化学成分）组成的复杂化学体系，其研究的是在复杂性科学理论的指导下，采用层次化、系统化及逐步优化的研究策略，而且首先要强调整体有效，即能够产生预期的生物学响应［9］。有文献报道板蓝根中的鸟苷、腺苷、尿苷等核苷有抗病毒作用，近年来也有研究发现（R，S）-告依春的抗病毒活性，而且在板蓝根这四种活性成分含量较高，可以将其看成一个化学物质组作为板蓝根质量控制的指标，进一步控制板蓝根药材的质量以及板蓝根在抗病毒中成药中的应用。

3.4 结论 由表2可知，每个产地的板蓝根药材所含的核苷类成分含量较大，如果以核苷类成分作为主要控制指标，则HB、DB、HX三地产板蓝根质量较好；如果以（R，S）-告依春作为含测指标，则AH产板蓝根质量较好，其他地区所产板蓝根（R，S）-告依春的含量差别不大；如果以化学物质组总含量作为评价指标，则AH产、HB产和DB产板蓝根质量较好。同样，以甘肃地区为例，每个产区指标的含量差异也比较明显，没有特别的规律性。本试验所收集的样本尚较少，每个产区仅一批样品，尚不足以代表各个产区板蓝根的质量，本试验仅以此作为一研究思路供研究使用。