基于网络药理学葛根治疗2型糖尿病的分子机制研究*

★ 李冰涛 翟兴英 涂珺 章辉 王浩臣 肖思雨 徐国良 严小军 邵峰 朱卫丰 刘荣华***（.江西中医药大学中医基础理论分化发展研究中心 南昌 330004; .江西中医药大学药学院 南昌 330004）

由于饮食结构的调整和生活方式转变等因素的影响，糖尿病逐渐成为威胁人类健康的重大慢性非传染性疾病。统计数据显示2017年全球糖尿病患者达4亿，中国糖尿病患者1.14亿，发病率约为总人口的10.9%。2型糖尿病患者占糖尿病总人口的90%左右。胰岛素抵抗和胰岛β细胞损伤导致外周组织肝脏、脂肪和骨骼肌对胰岛素的敏感性下降是2型糖尿病的基本病理［1-2］。持续的高血糖，引起组织器官的糖毒性，诱发糖尿病并发症，严重影响患者的生活质量及生命安全。

葛根是为豆科植物野葛（Pueraria lobata（Willd.）Ohwi）的干燥根，具有退热解肌、生津止渴等功效。其主要成分包括异黄酮类、三萜类等［3］，具有抗炎、抗氧化、降血糖、降血脂、改善胰岛素抵抗等药理活性［4］。葛根主消渴，是2型糖尿病治疗的常用中药，其作用机制可能与胰岛素信号通路相关［5-6］。

本课题组认为葛根改善胰岛素抵抗、治疗2型糖尿病可能是通过多靶点、多通路协同作用的结果。网络药理学是理解中药方剂复杂化学体系与病证复杂生物系统的相互作用的科学方法［7］。本研究应用网络药理学研究思路，检索葛根的化学成分，结合类药性分析技术筛选葛根的有效成分，预测其治疗靶点，结合2型糖尿病的疾病网络，分析葛根治疗2型糖尿病的靶点，构建葛根治疗2型糖尿病的靶点交互作用网络，富集葛根治疗2型糖尿病的代谢通路，阐述葛根治疗2型糖尿病的作用机制，为葛根治疗2型糖尿病的实验研究及产品开发提供科学依据。研究流程见图1。

图1 葛根治疗2型糖尿病分子机制研究流程图

1 方法

1.1 葛根化学成分及类药性分析［8-9］化学专业数据库由中科院上海有机化学研究所承担建设，服务于化学化工研究和开发的综合性信息系统。本研究依据化学专业数据库的二级数据库植物化学成分数据库检索葛根化学成分。检索词为“葛”，物种名称Pueraria lobata，学名Pueraria lobata（Willd.）Ohwi。检索时间：2018年8月1日。为查找葛根的化学成分，删除来源于茎、叶的化学成分，保留来源于地下根化学成分。使用PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和ChemicalBook（http://www.chemicalbook.com/）平台对其分子结构进行确证，最后将化合物保存为SDF或Mol格式文件。

类药性分析是分析化合物成为药物的可能性，Linpinski五规则是类药性分析的经典方法，也是对口服药物类药性经验型规律总结。具体内容包括分子量小于500；氢键给体数目小于5；氢键受体数目小于10；脂水分配系数小于5。符合Lipinski规则的化合物会有更好的药代动力学性质，在生物体内代谢过程中会有更高的生物利用度。如果化合物违背5规则2个以上，这个化合物成药的可能性就比较低。由于传统葛根治疗2型糖尿病给药途径是口服给药，本研究对葛根化学成分依据Linpinski规则进行类药性分析。

1.2 葛根作用靶点预测［10］药材化学成分通过与人体特定靶点相结合，通过调节靶点生物活性或转录水平，使药物发挥治疗疾病的作用。依据分子相似性原理，应用化学计量学方法，预测化学成分的作用靶点，是化合物作用靶点预测有效方法。本研究Swiss target prediction在线分析软件，预测葛根中有效化学成分的作用靶点，并将概率值大于0.5大分子作该成分的有效靶点，提取作用靶基因名称构建葛根化学成分靶点交互作用网络。

1.3 葛根“成分-靶点”网络构建 Cytoscape是一款图形化显示网络并进行分析和编辑的软件，依据葛根化学成分与作用靶点的对应关系，使用Cytoscape 3.2.1构建葛根化学成分-作用靶点网络。使用Excel构建成分靶点对应关系，然后将Excel文件导入cytoscape软件以完成相关网络构建，其中用“节点”（node）表示化学成分、作用靶点，用“边”（edge）表示成分与靶点之间关系。

1.4 葛根治疗2型糖尿病蛋白质交互作用网络（PPI） 糖尿病是一种慢性疾病，其发病机制复杂，涉及多个蛋白功能改变。本研究应用在线文本挖掘服务器CooLGeN（http：//ci.smu.edu.cn/CooLGeN/）获取2糖尿病疾病相关基因。具体设置为以type 2 diabetes mellitus为关键词，杂志影响因子选择5～40，发表年限为1980～2018年，检索数据库为MEDLINE，物种设置为人。检索有已报道2型糖尿病相关蛋白，提取80%以上疾病基因，作为疾病靶基因。

通过对于葛根治疗靶点及2型糖尿病疾病靶点交叉分析，获取葛根治疗2型糖尿病的靶点，将葛根对2型糖尿病的治疗靶点导入GeneMANIA蛋白质交互作用网络分析网站，构建葛根治疗2型糖尿病蛋白质交互作用网络。

1.5 葛根治疗2型糖尿病通路（pathway）富集分析 采用ClueGO分析插件，对上述葛根治疗2型糖尿病的作用网络涉及作用靶点，进行生物通路进行富集分析。方法是将葛根治疗2型糖尿病（protein-protein interaction network）PPI网络节点（基因名称）导入ClueGo插件，限定物种为人，经上述数据库检索和转化操作，设定阈值P＜0.05，evidience设定为all，进行通路（pathway）富集分析。

2 结果

2.1 葛根化学成分及类药性分析 通过检索化学专业数据库，本研究共检测到葛化学成分157种，其中无机物及金属离子6种，22个化学成分来源于葛根花、叶，10个化学成分结构信息尚在更新中。对其余119个化学成分分别使用Pubmed和Chemicalbook进行结构确认，另有19个化学成分结构信息无法确认。去除葛中金属离子、结构无法确认化合物及来源于花叶中的化学成分，本研究获得葛根化学成分100个。

计算葛根中化学成分的Linpinski参数，其中6个化学成分违背Linpinski规则，94个成分符合Linpinski规则，具有较好的类药性。将这些化学成分编号及CAS号整理，具体见表1。

表1 葛根类药性化学成分表

2.2 葛根化学成分-靶点网络 使用Swiss target prediction在线软件化学成分靶点预测软件，选择靶点概率大于0.5有效靶点。Excel建立化学成分-作用靶点的对应关系，Cytoscape构建成分-靶点的相互作用网络（图2）。由于94个类药性成分中24个成分预测靶点概率均小于0.5，视此成分无有效靶点，构建网络是不考虑此成分。网络基于葛根中70个化学成分，作用于180靶点。葛根成分-靶点网络作用图反映了葛根“多成分，多靶点”作用的特点，也提示葛根治疗2型糖尿病作用机制可能是与葛根多靶点作用相关。

图2 葛根类药性成分与靶点网络

2.3 葛根治疗2型糖尿病治疗靶点蛋白质交互作用网络 通过对CoolGEN数据库检索，研究共获得2型糖尿病疾病相关基因297个，通过与葛根180个治疗靶点的交互作用分析，发现13个疾病与葛根共有靶点（图3）。

图3 葛根作用靶点及2型糖尿病疾病靶点的交叉分析

机体的内在调控往往不是单一的信号通路支配的，而是复杂的调控网络。不同的信号通路和靶点之间会存在一定程度的信号转导，药物的治疗作用除表现为成分靶点的直接结合外，更多见于直接调控靶点与间接调控其他靶点相结合的调控方式。而蛋白质相互作用关系数据为寻找靶点的直接、间接调控作用关系提供了可能。为探索葛根治疗2型糖尿病的作用机制，研究将葛根治疗2型糖尿病的作用靶点13个靶点，以基因名称导入GeneMANIA数据库，构建起蛋白质交互作用网络（图4），该网络共有33个蛋白。

图4 葛根治疗2型糖尿病靶点蛋白质交互作用图（圆圈大小：节点度；线条粗细：交互作用可能性）

2.4 葛根治疗2型糖尿病靶点的通路富集分析 依据葛根治疗2型糖尿病靶点交互作用网络，提取相互作用靶点以基因名称导入ClueGo，对葛根治疗2型糖尿病靶点进行通路富集分析。富集结果见图5。通过对生物通路的富集分析，发现葛根治疗2型糖尿病通路包括脂肪摄取及消化，PPAR信号通路，甘油三酯催化通路及甘油三酯代谢通路，游离脂肪酸通路及长链脂肪酸通路，调节脂肪细胞脂化，前列腺素合成及调节通路，硒微量元素网络通路，色氨酸代谢通路，AGE/RAGE通路等14条代谢通路。

图5 葛根治疗2型糖尿病相关通路网络

3 讨论

2型糖尿病是是一种血糖升高为主要特征的代谢性疾病，其临床表现主要是血糖升高、脂代谢紊乱。胰岛素抵抗是指主要的病理因素，目前认为胰岛素抵抗的发病机制复杂，其中脂毒性学说、微量元素缺乏学说、慢性炎症学说是糖尿病重要发病机制学说。葛根主消渴，2型糖尿病属消渴的范畴，研究表明葛根及主要成分葛根素具有降血糖、降血脂，治疗2型糖尿病。探索葛根治疗2型糖尿病的作用机制对于葛根的临床应用及产品开发具有重要的意义。

本研究应用网络药理学方法，探索葛根治疗2型糖尿病的机制。发现94个具有较好的吸收特征葛根化学成分，这些化学成分可能是葛根药效的物质基础。依据分子相似性原理预测化学成分作用靶点，葛根化学成分主要作用180个靶点，其中13个靶点为药材与疾病共有靶点，通过蛋白质交互作用分析，构建基于33个基因交互作用靶点网络。对葛根治疗2型糖尿病的蛋白质交互作用网络上蛋白进行通路富集分析，葛根治疗2型糖尿病的通路包括脂肪摄取及消化，PPAR信号通路，甘油三酯催化通路及甘油三酯代谢通路，游离脂肪酸联合长链脂肪酸通路，调节脂肪细胞细胞中脂质分解等14条通路。

葛根治疗2型糖尿病的主要机制可能与葛根对脂质的影响有关。葛根影响脂肪消化和吸收，从而减少外源性脂肪进入体内；其次影响甘油三酯的催化和代谢，降低体内甘油三酯的水平；再次影响脂肪酸结合蛋白与长链脂肪酸的结合，从而影响循环系统脂肪酸含量。目前研究证实具有改善2型糖尿病脂代谢紊乱，降低甘油三酯和游离脂肪酸水平［11］。PPAR信号通路可能在葛根改善糖尿病患者脂肪水平过程发挥重要作用。PPAR是过氧化物酶体增殖剂激活受体，主要包括α，β/δ，γ三种亚型。PPARα主要表达于脂肪酸分解代谢速度较快的棕色脂肪细胞中，其次表达于肝、肾、心脏、骨骼肌细胞中，PPARα可以通过多种通路调节胆固醇和游离脂肪酸［12］，PPARβ的表达较为广泛，在脂肪酸的分解代谢、能量代谢及胆固醇逆向转运中起一定作用。PPARγ其次表达于肾、脾、肝脏、小肠、骨骼肌和巨噬细胞中，已被证明对调节糖脂代谢有着重要的作用［13］。葛根及葛根素可以调节是实验动物和脂肪细胞中PPARγ的表达，改善胰岛素抵抗模式生物的糖脂代谢紊乱［14-15］。

上述通路富集结果还显示，网络集群中还覆盖了硒微量元素网络，前列腺素合成及调节通路、脂肪组织中脂质水解，色氨酸代谢，AGEs/RAGEs通路。因此除了影响糖尿病患者脂质代谢，改善脂代谢紊乱治疗糖尿病病外，葛根还具有影响体内多种通路发挥抗糖尿病的作用。

本研究基于网络药理学分析药物与疾病相互网络关系，有效地揭示葛根治疗2型糖尿病的作用机制，为葛根治疗型糖尿病的实验设计的优化及葛根产品开发提供了实验依据。