用Chelex-100方法从牦牛乳中提取总DNA扩增线粒体DNA序列

罗卉卉，金素钰，黄 林，郑玉才

（西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041）

乳中的体细胞主要包括白细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和少量乳腺上皮细胞[1].健康奶牛乳中体细胞数量约2×104～2×105个/mL[2]，虽然远低于血液中的白细胞浓度（通常为4×106～10×106个/mL），但仍能用于提取DNA[3-4].乳中提取DNA的方法有很多.Volk等人[5]采用苯酚—氯仿法从2 mL牛乳中提取DNA，方法中使用了氯仿、异丙醇等有害试剂，且实验耗时较长；崔艳华[6]采用盐析法从50 mL牦牛乳中提取DNA，提取步骤较为复杂；Liu等人[7]采用丙酮法和SDS—苯酚法从13 mL牛乳中提取DNA；Psifidi等人[8]采用商业试剂盒法提取乳中DNA，但试剂较昂贵.综上所述，目前从牛乳中提取DNA的方法往往耗时较长、试剂价格高，并且需要较大体积的牛乳（2 mL～50 mL），有时还会使用有害试剂而影响操作人员或环境.

Amills等（1997）报道了利用Chelex-100方法从乳中快速提取基因组DNA，用于扩增一些核基因.由于线粒体DNA常被运用于疾病诊断、遗传等分析[9]，本研究建立了一种简单、快速、无毒且廉价的从少量牦牛乳中分离总DNA的方法，扩增线粒体DNA的D-loop区和细胞色素b基因（Cytb）.

1 材料与方法

1.1 乳样的采集和处理

麦洼牦牛（Bos grunniens）乳样采自四川省红原县.于7月份泌乳高峰季节，在早晨对全奶麦洼牦牛（采样当年产犊）和半奶麦洼牦牛（采样前一年产犊）各10头手工挤乳，每头采集约50 mL全乳，冰冻后用冰瓶带回实验室.

每个乳样取部分以800 g于4℃离心20 min，制备的脱脂乳分装.所有样品均保存于-80℃.实验时全乳和脱脂乳样品已保存约2年.

1.2 牦牛乳中DNA的提取

参考Amills等[10]的方法，采用 Chelex-100提取麦洼牦牛全乳和脱脂乳中的DNA.主要过程:取20 μL全乳或脱脂乳加入到980 μL超纯水中，涡旋15 s，再以12000 g室温离心3 min；沉淀用100 μL的5%Chelex-100（Bio-Rad，美国）重悬，再加入 4 μL 的 10 mg/mL新鲜蛋白酶K（Bio-Froxx，德国），56℃金属浴55 min后，于沸水浴中变性8 min，冷却后于-20℃保存.

1.3 用PCR扩增线粒体DNA两个基因序列

根据GenBank数据库中普通牛基因组序列（登录号:NC＿006853.1），用Premier 5.0软件设计扩增线粒体DNA的D-loop区的PCR引物.Cytb基因的引物参考胡强等的报道[11].D-loop-F:ccatcaacccccaaagctgaagttc， D-loop-R:caggaaggctgggaccaaacctatg； cytb-F:taccatgaggacaaatatcattctg，cytb-R:cctcctagtttgttagggattgatcg.预期扩增片段长分别为1045 bp和472 bp.引物由擎科梓熙生物技术有限公司合成.

以乳中提取的DNA为模板进行PCR扩增（PCR仪，Bio-Rad）.D-loop和 Cytb基因的 PCR反应体系（25 μL）:DNA 模板2 μL，上、下游引物（10 μM）各 1 μL，Golden Star T6 Super PCR Mix（擎科梓熙）21 μL.PCR扩增程序:98℃ 预变性3 min；98℃变性30 s，退火（温度:D-loop为60℃，Cytb基因为55℃）30 s，72℃延伸30 s，45个循环；最后72℃延伸5 min.PCR产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测.

为比较全乳与脱脂乳、全奶与半奶牦牛乳提取DNA的PCR扩增差异，取全乳、脱脂乳提取的DNA各6个，及全奶牦牛乳、半奶牦牛乳提取的DNA各6个，分别扩增Cytb基因，比较PCR扩增效果.同时，取全奶牦牛全乳提取的DNA两个，分别扩增35、40、45、50、55个循环，比较不同循环数PCR扩增效果.

1.4 PCR产物的直接测序

为检验乳中提取DNA的PCR产物是否可用于后续研究，将乳中提取DNA扩增Cytb基因的PCR产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，由生工生物工程有限公司进行产物直接测序.获得的序列与GenBank数据库中普通牛基因组序列（登录号:NC＿006853.1）进行比对.

2 结果

2.1 乳中DNA的提取及线粒体DNA的PCR扩增

以麦洼牦牛（n＝10）全乳中提取的DNA为模板，用PCR扩增线粒体 D-loop区和Cytb基因的部分片段，琼脂糖凝胶电泳可显示与预期片段大小相符的、特异的扩增产物条带，条带亮度较大，无杂带（图1）.但个体间的扩增效率存在差异（如图1B中，Q4和Q10样品扩增条带较暗）.

2.2 不同牦牛乳DNA对PCR扩增Cytb基因的影响

以半奶牦牛（n＝6）全乳、脱脂乳提取的DNA为模板，扩增Cytb基因效果存在差异（图2A）.全乳提取DNA扩增条带亮度明显大于脱脂乳，同时个体之间也存在差异.表明Cytb基因的扩增可采用全乳，也可采用脱脂乳提取DNA作为模板，但是全乳效果更好.

比较6头全奶牦牛和6头半奶牦牛的全乳提取的DNA扩增Cytb基因效果，发现虽然均能进行PCR扩增，并存在个体差异，但半奶牦牛乳提取的DNA，扩增条带总体更亮（图2B）.

2.3 循环数对PCR扩增Cytb基因的影响

以2头全奶牦牛（A和B）全乳提取的DNA为模板，比较循环数对PCR扩增Cytb基因的影响.发现当扩增循环数从35增至55时，条带亮度增加，但45个以下循环的扩增条带亮度较弱（图3）.

2.4 乳DNA的PCR扩增产物的测序

以乳DNA为模板，PCR扩增Cytb基因的产物直接测序表明，测序峰图清晰（图4），能正确获得序列.通过与GenBank数据库中普通牛基因组序列（登录号:NC＿006853.1）进行比对，证实该基因确实为Cytb基因，表明扩增产物可应用于进一步实验.

图1 PCR扩增牦牛乳源线粒体DNA的D-loop区和Cytb基因的琼脂糖凝胶电泳图（A）和（B）分别为扩增mtDNA D-loop区、Cytb基因的结果.M为DNA Marker；Q1～Q10为10头全奶牦牛的全乳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the PCR products of mtDNA D-loop region and Cytb gene amplified using yak milk DNA templates（A）and（B）are the results of amplification of mtDNA D-loop region and Cytb gene from whole milk DNA；M:DNA Marker；Q1 ～ Q10 are the whole milk samples of 10 total lactating yaks

图2 不同牦牛乳提取DNA扩增Cytb基因的琼脂糖凝胶电泳图（A）和（B）分别为牦牛脱脂乳和全乳、半奶牦牛和全奶牦牛全乳DNA扩增Cytb基因的结果；M为DNA Marker；BT1～BT6和B1～B6分别为6头半奶牦牛的脱脂乳和全乳；B1～B6和Q1～Q6分别为半奶牦牛和全奶牦牛不同个体的全乳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of Cytb gene amplified using DNA extracted from different yak milk samples（A） and （B） are the results amplifying the Cytb gene using DNA extracted from yak whole milk and skim milk，and milk of half-lactating yak and total-lactating yak，respectively；M:DNA Marker；BT1 to BT6 and B1 to B6 are skim milk and whole milk of six half-lactating yaks，respectively；B1 ～ B6 and Q1 ～ Q6 are whole milk of half-lactating yaks and total-lactating yaks，respectively

图3 全奶牦牛全乳DNA在不同循环数下扩增Cytb基因琼脂糖凝胶电泳图M为DNA Marker；A、B为两个牦牛样品，图下数字为PCR循环数.Fig.3 Agarose gel electrophoresis of Cytb gene amplified from whole milk DNA of total-lactating yak at different cyclesM:DNA Marker；A and B are two yak samples.The figure under the map shows the number of PCR cycles.

图4 全奶牦牛全乳DNA扩增细胞Cytb基因的部分测序峰图Fig.4 Sequence peak map of the partial Cytb gene amplified using whole milk DNA of total-lactating yak

3 讨论

本研究建立了从牦牛乳中快速提取总DNA扩增线粒体Cytb基因、D-loop区的方法，扩增产物条带清晰，无杂带，可用于直接测序并获得正确的结果.Amills等人[11]用 Chelex-100法从牛乳中提取了DNA，用于扩增细胞核中的多个功能基因和微卫星序列，并未涉及线粒体基因.而本研究表明，提取的DNA还可用于扩增线粒体 DNA，其中 D-loop区长度达1000 bp左右（图1），产物的进一步测序等可为基于乳样品的遗传学分析提供科学的数据.

Chelex-100方法提取的乳DNA在扩增时存在个体差异，某些样品在相同条件下扩增条带较淡（图1 B），这可能与乳中细胞数量差异有关.有研究表明，牛乳中体细胞数量受许多因素影响，例如品种、产奶量、泌乳阶段和个体差异等[12].Usman[13]等人采用试剂盒方法提取的牛乳DNA进行PCR扩增，条带亮度也存在明显的个体差异.另外，Chelex-100法提取全乳、脱脂乳DNA扩增线粒体DNA的Cytb基因或D-loop区的效果存在明显差异（图2A），这可能也与二者的体细胞数量差异有关.脱脂乳比全乳中体细胞数量低[14].虽然牦牛全乳所提DNA扩增效果比脱脂乳好，但脱脂乳也能用于提取DNA.由于脱脂乳更易保存，这扩展了基于乳中DNA的PCR分析.类似的机制也可解释半奶牦牛乳DNA扩增效果好于全奶牦牛的原因.有研究表明，半奶牦牛与产犊当年挤乳的全奶牦牛相比，虽然挤乳量显著下降，但是乳蛋白、乳脂含量极显著增加[15].因此，半奶牦牛乳更适合用Chelex-100方法提取总DNA.

全奶牦牛全乳提取的DNA在PCR扩增Cytb基因时，45循环数以下扩增条带较淡.Amills等人[11]用Chelex-100法从牛乳中提取的DNA在PCR扩增45循环以下时，扩增条带亮度也不高.结合本研究结果，作者认为用Chelex-100方法从乳中提取DNA用于PCR时，其循环数应大于45个循环.综上所述，本研究建立了用Chelex-100方法快速提取牦牛全乳和脱脂乳DNA，并扩增线粒体DNA的D-loop区和Cytb基因的方法，为基于乳的分子遗传研究提供了可靠的技术.