有氧运动及膳食干预对胰岛素抵抗大鼠心肌过氧化物酶体增殖物激活受体γ的影响

吴菊花 刘无逸 (广西科技大学，广西 柳州 545006)

胰岛素抵抗与2型糖尿病发生发展紧密相联，可使机体产生心肌梗死、糖尿病性心肌病等疾病，其过程中易产生心肌脂质代谢紊乱。有研究表明，心肌细胞脂质代谢及能量代谢紊乱可能导致心肌产生多种疾病〔1，2〕。而过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)在调节脂肪酸氧化酶活性、促进脂代谢、改善血脂及抗氧化、抗炎、抗凋亡等方面作用显著，尤其在脂代谢和糖代谢方面扮演重要角色，已引起众多学者关注〔3，4〕。PPARγ是PPARs亚型之一，是脂肪细胞分化的关键调控因子之一，可增加脂肪细胞数量，促进脂肪细胞三酰甘油合成，有效调剂脂质代谢过程，经激动剂激活后也可增强胰岛素敏感性。本实验旨在观察有氧运动及膳食干预下，胰岛素抵抗大鼠心肌PPARγ表达是否发生变化，进而确定有氧运动及膳食干预对胰岛素抵抗大鼠心肌脂质代谢是否产生影响。

1 材料和方法

1.1 实验试剂及仪器 PPARγ抗体(SC-1984，美国Santa Cruz公司);山羊抗兔 IgG/辣根过氧化物酶(HRP)(碧云天生物技术研究所);β-actin(碧云天生物技术研究所);RIPA蛋白裂解液(P0013B，碧云天生物技术研究所);DSPT-202动物跑台(杭州段氏制造);电泳仪(美国Hoefer公司);转膜仪(北京百晶生物技术限公司)等。所有实验仪器及实验流程在上海体育学院运动健身科技省部共建教育部重点实验室运动分子中心操作进行。

1.2 实验动物及分组 选用清洁级健康雄性SD大鼠215只，7周龄，体重206～257 g。大鼠购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司，批准号为〔准 SCXK(沪)2003-0002〕。清洁级饲养室:5只/笼进行分组，光照12 h，天黑前投食，自由饮水;环境温度为22±2℃，相对湿度55.6%±4%。大鼠基础饲料适应性喂养1 w后，分为安静对照组(CON)15只，胰岛素抵抗模型组(MIR)200只。造膜成功后，MIR组分为高脂膳食安静对照组(DIO)15只、高脂膳食运动组(DE)15只、正常膳食安静对照组(NOR)15只、正常膳食运动组(NE)15只。CON组无任何干预;DIO组仅继续高脂喂养;DE组继续高脂饲料喂养8 w，同时进行中等强度跑台运动;NOR组改为基础饲料喂养;NE组改为基础饲料喂养8 w，同时进行中等强度跑台运动。

1.3 模型建立及运动方案 基础饲料:蛋白质22.0%，脂肪5.2%，碳水化合物52.0%，其他20.8%。高脂饲料:在上述饲料基础上，添加 10.0%猪油，15.0%蔗糖，0.2%胆固醇，0.2%蛋黄。基础饲料及高脂饲料由中国科学院上海斯莱克实验动物有限公司提供。

1.3.1 MIR建立 CON和MIR组不限食量饲养。CON组基础饲料喂养8 w;MIR组高脂饲料喂养8 w，随后进行口服糖耐量试验:大鼠空腹12 h，眼眶静脉取血以利舒坦血糖仪及试纸测即时空腹血糖(FBG)，同时留取空腹静脉血 0．5 ml。用 50%葡萄糖灌胃(2 g/kg)。于糖负荷后15、30、60和 120 min测即时血糖，并于每一时间点取血 0．5 ml，37℃ 静置 10～20 min，3 000 r/min 离心 5min，分离血清，－20℃保存，待测，并根据公式，计算葡萄糖曲线下面积(AUCg)和胰岛素曲线下面积(AUCi)。AUCg=1/2×(0 min+15 min)×0．25+1/2×(15 min+30 min)×0．25+1/2×(60 min+30 min)×0．5+1/2×(60 min+120 min)×1;AUCi=1/2×(0 min+15 min)×0．25+1/2×(15 min+30 min)×0．25+1/2×(60 min+30 min)×0．5+1/2×(60 min+120 min)×1。检验建模是否成功，测定FBG和空腹胰岛素(FIN)，并计算胰岛素敏感指数(ISI)。MIR组ISI显著低于CON组，表明模型建立成功。ISI=In〔1/(FBS×FIN)〕〔5〕。胰岛素为目前已知的唯一的降糖激素，其降糖作用发挥主要依赖于机体胰岛素敏感性达到某一稳定的平衡，血浆胰岛素及其组织敏感性都与血糖呈负相关，该公式可用于同一种群。模型建成后，将MIR组按体重排序，选取上游30%大鼠进行后续研究〔6〕。

1.3.2 运动方案 开始时连续运动9 d，第1天跑速10 m/min，持续时间 20 min，以后隔日增加速度2 m/min，持续时间增加 10 min，第 9天起跑速达18 m/min，持续时间达60 min，跑台坡度为5%，维持此强度，每周运动5 d，持续4 w;在第5～8周将跑速调节到 20 m/min，其余和前 4 w 相同〔7〕。

1.4 取材及实验方法 末次运动训练后，于第2天早晨用水合氯醛腹腔麻醉各组大鼠，取心脏，置于－80℃冰箱，冰冻处理。Western印迹半定量测定 PPARγ表达。

1.5 Western印迹 取200 mg心肌，加入1 ml RIPA裂解液和蛋白酶及磷酸酶抑制剂，置于冰上，进行玻璃匀浆器研磨;4℃ 12 000 r/min离心10 min，取上清，保存于－20℃冰箱，待用。取适量蛋白与十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)蛋白上样缓冲液(2×)，1∶1混匀，沸水煮 6～8 min，冷却后保存于－20℃。取蛋白样品60 μg上样，60 V电压，在5%浓缩胶中浓缩约1.5 h;80 V电压，在12%分离胶中分离约2.5 h;以120 V电压转膜约2 h。封闭:5%脱脂奶粉中4℃过夜。将NC膜置于一抗(PPARγ抗体:1∶500;β-actin:1∶1 000)中，4℃过夜;次日 TBST 洗涤 5×5 min，敷二抗(山羊抗兔IgG/HRP:1∶1 000)。室温下摇床2 h;电化学发光法(ECL)发光，暗室显影，灰度分析。

1.6 数据处理 Quantity One软件读取蛋白条带的积分灰度值，Western印迹结果用目的蛋白积分灰度值与内参蛋白积分灰度值的比值表示。GraphPad Prism 5进行数理统计及图像生成，采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结果

2.1 胰岛素抵抗大鼠建模成功 两组葡萄糖吸收符合正常代谢过程，即均先升高然后逐渐下降。MIR组血糖上升幅度显著高于CON组(P＜0.05，P＜0.01)。MIR组血浆胰岛素浓度显著高于CON组(P＜0.01)。CON组与MIR组FBG差异无统计学意义(P＞0.05)，FIN和ISI差异有统计学意义(P＜0.05)。表明建模成功，见表 1，表 2。

表1 CON组和MIR组血糖及胰岛素浓度比较(，n=8)

表1 CON组和MIR组血糖及胰岛素浓度比较(，n=8)

与 CON 组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01，同表 2

组别 血糖(mmol/L)胰岛素(μU/ml)0 min 15 min 30 min 60 min 120 min 0 min 15 min 30 min 60 min 120 min CON 组 5.25±0.11 7.10±1.15 9.27±0.66 9.83±0.81 7.72±0.88 26.76±5.90 58.98±10.63 46.08±12.22 28.26±1.38 26.12±1.58 MIR 组 5.47±0.77 8.94±1.522) 10.48±0.792) 12.10±2.302) 10.36±2.801) 77.56±7.291)127.09±15.511)92.51±6.471) 87.71±8.851)60.74±10.461)

表2 CON组和MIR组FBG、FIN、ISI比较(，n=8)

表2 CON组和MIR组FBG、FIN、ISI比较(，n=8)

组别 n FBG(mmol/L) FIN(μU/ml) ISI AUCg AUCi CON 组 15 5.25±0.15 26.76±6.69 －4.92±0.22 17.14±1.08 69.62±7.66 MIR 组 60 5.47±0.77 77.56±7.291) －6.04±0.191) 21.10±3.422) 172.31±9.132)

2.2 8 w有氧运动及膳食干预后各组大鼠体重的变 化 与CON组相比，NE组NOR组、DIO组和DE组体重均显著升高(P＜0.05)。与DIO组相比，从第2周干预起，NOR组和DE组体重均显著降低(P＜0.05);从第3周干预起，NE组显著性低于DIO组(P＜0.05)。见表3。

表3 8 w有氧运动及膳食干预后大鼠体重的变化(，g，n=8)

表3 8 w有氧运动及膳食干预后大鼠体重的变化(，g，n=8)

与CON组比较:1)P＜0.05;与DIO组比较:2)P＜0.05;下表同

组别 第1周 第2周 第3周 第4周 第5周 第6周 第7周 第8周CON 组 484±28 496±25 504±23 508±24 512±23 515±22 519±22 522±23 NE 组 577±331) 579±321) 571±321)2) 565±301)2) 557±301)2) 552±291)2) 546±291)2) 540±32)NOR 组 575±231) 563±261)2) 558±271)2) 561±241)2) 564±241)2) 566±241)2) 568±271)2) 571±271)2)DIO 组 586±271) 609±221) 623±191) 637±161) 644±151) 653±151) 662±181) 670±171)DE 组 571±291) 574±291)2) 574±281)2) 570±281)2) 568±281)2) 566±261)2) 563±261)2) 561±231)2)

2.3 8 w有氧运动及膳食干预后各组FBG、FIN、ISI比较 5组FBG水平差异无统计学意义(P＞0.05);与CON组相比，DIO组FIN、ISI差异有统计学意义(P＜0.05);与DIO组相比，DE组、NE组和NOR组FIN、ISI差异有统计学意义(P＜0.05)。见表4。

表4 8 w有氧运动及膳食干预后各组FBG、FIN、ISI表达比较(，n=8)

表4 8 w有氧运动及膳食干预后各组FBG、FIN、ISI表达比较(，n=8)

组别 FBG(mmol/L) FIN(μU/ml) ISI CON 组 5.52±0.50 23.77±5.03 －4.85±0.17 DIO 组 6.06±1.07 131.60±22.881) －6.66±0.271)DE 组 5.62±0.33 41.45±16.402) －5.38±0.472)NOR组 5.54±0.59 29.86±9.722) －5.06±0.402)NE 组 5.56±0.50 35.85±5.222) －5.28±0.202)

2.4 8 w有氧运动及膳食干预后各组心脏重量(HW)和心脏重量指数(HW/BW)比较 NOR组HW明显高于CON组(P＜0.05);DIO组明显高于DE组、NE组和NOR组(P＜0.05)，且显著高于CON组(P＜0.01)。NE组HW/BW显著高于CON组(P＜0.01)，NOR组和NE组显著高于DIO组(P＜0.01)。见表5。

2.5 8 w有氧运动及膳食干预后各组心肌PPAR-γ比较 DE组和NE组心肌PPARγ表达量(0.87±0.09、0.88±0.09)显著高于 CON 组(0.69±0.03，P＜0.05)，DIO组(0.53±0.07)显著低于CON组(P＜0.05);DE组和NE组显著性高于DIO组(P＜0.05)。NOR组为0.60±0.09。见图 1。

表5 8 w有氧运动及膳食干预后各组大鼠HW和HW/BW的变化(，n=8)

表5 8 w有氧运动及膳食干预后各组大鼠HW和HW/BW的变化(，n=8)

与CON 组相比:1)P＜0.05，2)P＜0.01;与 DIO 组相比:3)P＜0.05

组别 HW(mg) HW/BW(mg/g)CON 1.24±0.08 2.5±0.183 DIO 1.53±0.231) 2.3±0.377 DE 1.24±0.103) 2.5±0.210 NOR 1.39±0.272)3) 2.8±0.7263)NE 1.28±0.123) 2.6±0.2262)3)

3 讨论

图1 心肌PPAR-γ Western印迹

国外研究〔8，9〕表明，高脂饲料诱导所致的肥胖动物模型，符合人类肥胖-胰岛素抵抗实际特征，因此本实验选择高脂饲料喂养进行胰岛素抵抗模型构造。

诱发心脏功能障碍的一个重要因素是心肌胰岛素抵抗，心肌胰岛素抵抗重要特征之一即心肌细胞内长链脂肪酸(LCFA)代谢持续储积〔10〕，心肌脂代谢出现紊乱。PPARγ表达于心肌细胞中，可调控脂肪细胞分化基因表达，提高细胞质脂解能力，增强脂肪酸向细胞运输能力，影响细胞对胰岛素敏感性，从而影响糖脂代谢，改善胰岛素抵抗。Weismann等〔11〕通过敲除Trib3基因大鼠的胰岛素抵抗模型，观察PPARγ对大鼠胰岛素敏感性调节状况，发现大鼠的胰岛素敏感性调节主要依靠PPARγ进行，由此可见，PPARγ与胰岛素抵抗疾病的发生有重要关系。Sone等〔12〕以138名日本男性为研究对象，根据其是否具有习惯性运动，检查其血脂变化，发现具有习惯性运动男性的血脂通过PPARγ调节，其血脂具有显著改善。

适度有氧运动可降低体重，上调脂代谢，减轻胰岛素抵抗。Marinho等〔13〕研究发现任何强度有氧运动都可以有效增强小鼠胰岛素敏感性。Fedewa等〔14〕对运动是否能够改善青少年胰岛素抵抗，进行Meta分析，结果表明小强度到中等强度的运动可以有效改善其胰岛素抵抗状况。一份2003～2004年度美国国民健康与营养调查报告〔15〕显示，每天适量的身体运动可有效降低胰岛素抵抗程度，对于改善血糖代谢，维持血糖稳定而言，是一个重要的决定因素。Ruschke等〔16〕研究中，对153例患者进行为期4 w的加强性运动，发现患者的PPARγ与胰岛素抵抗有相关性，且其 PPARγ mRNA表达量增加，有利于提高患者胰岛素敏感性。总之，胰岛素抵抗患者保持适当的有氧运动即可改善其胰岛素抵抗症状。

有氧运动除了可改善胰岛素抵抗症状之外，也有学者从膳食方面对胰岛素抵抗的改善进行了研究。研究发现为期6个月的低脂饮食可以有效改善胰岛素抵抗现象〔17〕。另外，胰岛素抵抗的发生风险与维生素D摄入量呈显著负相关〔18〕，表明在胰岛素抵抗患者的膳食摄入中应增加维生素D的含量。同时，有研究发现增加不饱和脂肪酸和膳食纤维的摄入量，可以大幅度减少青少年日后胰岛素抵抗疾病的发生〔19〕。

由于有氧运动和膳食改变可改善胰岛素抵抗状态，研究者将运动和饮食限制结合起来对具有胰岛素抵抗的肥胖大鼠进行干预，结果发现两者结合改善了大鼠肥胖所致的炎症和胰岛素抵抗所致的血管舒张〔20〕。但是关于两者结合干预胰岛素抵抗的研究并不多见，且对有氧运动、膳食改变和有氧运动结合膳食改变这三种干预胰岛素抵抗的方式间并未有比较性的研究。本研究结果表明有氧运动结合膳食干预对于大鼠体重控制的效果最为明显。FIN、ISI和PPARγ都有效反映了机体的糖脂代谢和胰岛素抵抗程度。本研究发现，有氧运动和膳食干预均有效地不同程度增加大鼠心肌PPARγ表达，减轻胰岛素抵抗，而有氧运动与膳食干预相比，更有效地增加大鼠心肌PPARγ表达，改善了胰岛素抵抗，而两者叠加进行干预，则效果更显著。

综上，PPARγ在体内糖脂代谢中作用复杂，有氧运动或(和)膳食干预如何影响PPARγ表达还需进一步研究。目前针对PPARγ如何改善胰岛素抵抗中的脂质代谢的机制仍存在一定争议，仍需大量实验研究证实。