支链siRNA多靶点对乳腺癌4T1细胞凋亡作用的影响

周 悦 莫 黎 王 辛 周庆伟 (南京中医药大学药学院，江苏 南京 20029)

乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，也是导致肿瘤相关死亡的主要原因之一〔1〕。近年来，我国乳腺癌发病率逐年攀升。上海、北京、天津及沿海地区为高发区，流行趋势明显改变为城市高于农村，沿海地区高于内地，乳腺癌严重影响了患者的生活及生存质量。因此，对乳腺癌发病机制及开发新药研究尤为重要〔2〕。随着对乳腺癌研究的深入，研究者们对传统的治疗，如手术、化疗、放疗及分子靶向治疗疗效重新审视，目前尚无有效的治疗手段。因此寻找新的乳腺癌治疗策略尤为必要。近年来，以小干扰RNA(siRNA)为基础的干扰(RNAi)技术发展迅速，其以低毒、特异和高效等优势越来越广泛受到研究者的关注并取得了显著进展〔3〕。为此，本实验设计了支链siRNA多靶点抑制剂作用于乳腺癌4T1细胞，分析并探讨其对乳腺癌细胞增殖及凋亡作用的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂 乳腺癌4T1细胞(购自中国科学院上海细胞生物学研究所)，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司提供;MTT由美国Sigma生产;Lipofectamine2000试剂OPTI-MEM(1X)均由美国生产;标准胎牛血清由天津灏洋生物制品科技有限责任公司生产。

1.2 序列合成 RNA oligo合成由上海GenePharma公司提供。

1.3 主要仪器 倒置光学显微镜(日本NiKon ECLIPSE 80i);二氧化碳培养箱(日本三洋电机株式会社制造);酶标仪(中国北京普朗新有限公司);荧光显微镜及流式细胞仪(日本Olympus Tokyo)。

1.4 实验分组 分为正常对照组﹑阴性对照组(0.003 μg/μl)、siRNA-STAT3 组 (0.066 μg/μl) ﹑siRNA-STAT6 组 (0.066 μg/μl) ﹑ siRNA-STAT5a(0.066 μg/μl)组及 siRNA-STAT5b(0.066 μg/μl)组;Mixture组(0.26 μg/μl)由4种基因序列混合液配制;各实验组均按GenePharma公司说明书配置操作。Lipofectamine2000转染试剂按说明书完成。每实验组乳腺癌4T1细胞转染6 h后，弃掉培养液，各组均按实验要求检测各种指标。

1.5 MTT法检测乳腺癌4T1细胞增殖活性 取对数生长期细胞，调整细胞悬液为2×104/ml，接种至96孔板，每孔 100 μl，每组设 4个复孔，置入 37℃，5%CO2培养箱中孵育，待细胞贴壁后，各组分别在24 h、48 h及72 h检测细胞增殖活性，并在每个时间点，每孔加入MTT溶液20 μl，置入培养箱中孵育4 h后，弃掉培养液，每孔加入150 μl DSMO，振荡器震荡10 min。采用酶标仪在490 nm下检测各实验组吸光值计算细胞存活率。

1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡 取对数生长期细胞，0.25%胰酶消化，1 500 r/min，离心 5 min，弃上清，调整细胞密度为1×106/ml，接种至6孔板，每实验孔分别加入1 ml细胞悬液及1 ml 10%细胞培养液，细胞贴壁后，置入37℃的5%CO2培养箱，孵育培养48 h;弃培养液，收集各组细胞，各实验组分别加入195 μl Annexin V-FITC 结合液，5 μl Annexin V-FITC 及 80 μl碘化吡啶，轻轻摇晃，室温避光，孵育 20 min，待上机检测。

1.7 统计学方法 采用SPSS18.0软件进行t检验。

2 结果

2.1 支链siRNA多靶点对乳腺癌4T1细胞增殖活性的影响 在24 h，Mixture组与正常对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05);Mixture组与其余各组比较差异无统计学意义(均P＞0.05);在48 h，Mixture组分别与正常对照组及阴性对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01);与 siRNA-STAT6组、siRNA-STAT5a及 siRNA-STAT5b组比较差异有统计学意义(P＜0.05);siRNA-STAT3组与正常对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05);在72 h，Mixture组与正常对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，与其余各组比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

2.2 支链siRNA多靶点对乳腺癌4T1细胞凋亡率的影响 在48 h，各实验组细胞凋亡率均明显低于Mixtrue组，差异有统计学意义(P＜0.05)，表明支链siRNA多靶点具有明显诱导乳腺癌4T1细胞凋亡的作用，见表1。

表1 支链RNA多靶点对乳腺癌4T1细胞增殖活性及凋亡率的影响()

表1 支链RNA多靶点对乳腺癌4T1细胞增殖活性及凋亡率的影响()

与正常对照组比较:1)P＜0.05;与阴性对照组比较:2)P＜0.01，与Mixture组比较:3)P＜0.05

组别 增殖活性(OD，n=4)24 h 48 h 72 h凋亡率(%，n=3)正常对照组 0.28±0.01 0.57±0.05 0.71±0.06 5．17±1．223)阴性对照组 0.26±0.04 0.57±0.03 0.70±0.02 6．70±0．323)siRNA-STAT3 组 0.24±0.06 0.46±0.021) 0.63±0.07 15．80±1．783)siRNA-STAT6 组 0.24±0.04 0.56±0.093) 0.63±0.05 8．59±2．203)siRNA-STAT5a 组 0.27±0.03 0.47±0.093) 0.62±0.09 11．89±1．373)siRNA-STAT5b 组 0.26±0.02 0.49±0.074) 0.64±0.04 11．98±1．933)Mixtrue 组 0.22±0.011)0.37±0.041)2)0.54±0.061)28．86±2．54

3 讨论

信号转导与转录激活因子(STATs)家族在肿瘤细胞增殖、凋亡及侵袭转移等方面发挥了及其重要作用。其中STAT3在恶性肿瘤中的研究最为广泛，并且参与了多种肿瘤的信号通路和胞内信号传导通路如乳腺癌、肺癌及肝癌等。研究显示，STATS蛋白家族可以被白细胞介素、生长因子类及某些恶性肿瘤蛋白等多种胞内因子受体激活的一组蛋白，共包括7个家族成员:如 STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b 及STAT6〔4，5〕。其中，STAT1、STAT5 和 STAT6 的异常表达可导致恶性肿瘤的发生、发展，而STAT3作为恶性肿瘤治疗的位点，因为STAT3激活后可产生免疫抑制效应，抑制了STAT3的过度表达不仅阻滞恶性肿瘤细胞过度增殖，同时还增强体内对肿瘤的免疫能力〔6〕。有研究报道，STAT5a在信号通路中的作用及对基因表达的调控研究较为广泛，STAT5a在乳腺组织正常发育过程中具有突出作用〔7，8〕，STAT5a 与 STAT5b 与乳腺癌病理生理学密切相关。STAT5a与STAT5b是最常见的转录因子组合，在调节乳腺癌上皮恶性肿瘤方面具有双重作用〔9〕。STAT5a的激活在调节乳腺细胞生长与分化方面和乳腺癌发生、发展中发挥重要作用〔10〕。研究表明，STAT6不仅在免疫系统的调节中发挥重要作用，而且与肿瘤细胞增殖、凋亡及肿瘤的发生相关〔11～15〕。

迄今为止，传统的肿瘤治疗方法如放、化疗及免疫治疗等存在着诸多局限性，RNAi作为新型的基因沉默技术，具有高特异性抑制靶基因的表达、疗效显著、副作用轻微等优点〔16，17〕，研究表明，信号转导通路的异常表达在肿瘤进程中起着重要作用〔18〕。恶性细胞无限增殖、侵袭及转移是肿瘤的主要特征，也是肿瘤恶性程度的重要标志。肿瘤的侵袭、转移是一个复杂的过程，涉及多个基因的异常表达，也受多种细胞因子调控〔19〕。细胞凋亡与增殖是肿瘤发生和发展的重要指标，这些变化的调控作为预兆的信息。因此，细胞凋亡和分裂指数关系到肿瘤患者的生存率〔20〕。本研究证实支链siRNA能够明显抑制乳腺癌4T1细胞增殖及促进诱导细胞凋亡。