甘草总黄酮对阿司匹林损伤人胃黏膜上皮细胞的保护作用及机制研究

李跃文，万强

本研究创新点：

长期服用阿司匹林可损伤人胃黏膜上皮细胞（GES-1），甘草总黄酮具有显著的胃黏膜保护和修复作用，但其对阿司匹林所致胃黏膜损伤的作用尚不清楚。本研究采用阿司匹林诱导GES-1损伤，加入甘草总黄酮和细胞外调节蛋白激酶（ERK1/2）阻滞剂PD98059干预，探讨甘草总黄酮对阿司匹林损伤GES-1的保护作用及机制。研究发现甘草总黄酮可显著降低阿司匹林对GES-1增殖的抑制，减少由阿司匹林诱导的GES-1凋亡，降低乳酸脱氢酶（LDH）活性及丙二醛（MDA）含量并增加超氧化物歧化酶（SOD）活性，并降低B淋巴细胞癌2（Bcl-2）表达，增加磷酸化细胞外调节蛋白激酶（p-ERK1/2）及Bcl-2相关X蛋白（Bax）表达；加入PD98059预处理可进一步增强甘草总黄酮上述药理作用，提示甘草总黄酮可通过促增殖、抗凋亡、抗氧化应激等途径减轻阿司匹林诱导的GES-1损伤，其机制可能与抑制ERK1/2信号通路有关。本研究创新点在于发现甘草总黄酮可通过抑制ERK1/2信号通路减轻阿司匹林诱导的GES-1损伤，研究结果有望为甘草总黄酮临床防治阿司匹林引起的胃黏膜损伤提供一定的实验依据。

非甾体抗炎药如阿司匹林（aspirin）临床广泛用于治疗风湿性疾病及预防心脑血管疾病，但长期使用可损伤胃黏膜，诱发溃疡和出血［1］。因此，积极研究并开发药物抑制阿司匹林所致的胃黏膜损伤，具有重要意义。中医药具有胃肠道不良反应小的特点，甘草总黄酮（licoflavone）是从豆科多年生草本中药甘草的根和根茎中分离纯化的黄酮制剂，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等药理作用［2］。既往研究证实甘草总黄酮对慢性浅表性胃炎及慢性萎缩性胃炎大鼠胃黏膜损伤均具有显著的保护和修复作用［3-4］，但其对阿司匹林所致胃黏膜损伤的作用尚不清楚。细胞外调节蛋白激酶（extra cellular regulated protein kinases，ERK1/2）信号通路与细胞的增殖、分化、凋亡密切相关，并在胃黏膜损伤的病理过程中起了关键作用［5］。本研究采用阿司匹林诱导人胃黏膜上皮细胞（gastric epithelial cells，GES-1）损伤，加入甘草总黄酮和ERK1/2阻滞剂PD98059干预，探讨甘草总黄酮对阿司匹林损伤GES-1的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1 研究时间 2017年3—11月。

1.2 实验材料 GES-1细胞株购于美国菌种保藏中心（ATCC）细胞库；甘草总黄酮购于惠州市九惠制药股份有限公司；阿司匹林（纯度≥99%）、二甲基亚砜（DMSO）、四甲基偶氮唑蓝（MTT）购于美国Sigma公司；DMEM培养基购于美国Invitrogen公司；胎牛血清购于美国Gibco公司；乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）试剂盒购于南京建成生物工程研究所；磷酸化细胞外调节蛋白激酶（p-ERK1/2）抗体、B淋巴细胞癌2（Bcl-2）抗体、Bcl-2相关X蛋白（Bax）抗体、β-actin抗体购于美国Abcam公司；PD98059购于英国Tocris Bioscience公司；Annexin V-异硫氰酸荧光素（FITC）/碘化丙啶（PI）细胞凋亡试剂盒购于中国Beyotime公司。

1.3 主要仪器 荧光倒置显微镜购于德国Leica公司；电泳仪购于美国Bio-Rad公司；流式细胞仪购于美国BD公司；冷冻高速离心机、酶标仪、二氧化碳细胞培养箱购于美国Thermo公司。

1.4 方法

1.4.1 GES-1培养及分组 GES-1加含15%胎牛血清的DMEM培养液，置于37 ℃、5%二氧化碳的培养箱。阿司匹林以1%羧甲基纤维素钠溶解后用DMEM培养液稀释至18.5 mmol/L。甘草总黄酮以0.1% DMSO溶解，制成母液备用。GES-1分组：对照组：加DMEM培养基；阿司匹林组：阿司匹林18.5 mmol/L与GES-1共同培养24 h［6］；甘草总黄酮低组、甘草总黄酮中组、甘草总黄酮高组：GES-1分别以甘草总黄酮（3、6、12 mg/L）预处理2 h后［7］再加阿司匹林18.5 mmol/L共同培养24 h；PD98059组：GES-1以甘草总黄酮12 mg/L预处理2 h后，加PD98059 10 μmol/L［8］处理1 h，再加阿司匹林18.5 mmol/L共同培养24 h。

1.4.2 MTT法检测细胞增殖 按2×104/孔的密度将GES-1加入96孔板，培养24 h后去血清，加MTT（5 g/L） 20 μl培养 4 h，去除培养液加 DMSO 100 μl振荡10 min使结晶完全溶解，酶标仪测定吸光度（A）值。细胞增殖抑制率（%）=〔1-（A实验组/A对照组）〕×100%。

1.4.3 流式细胞术检测细胞凋亡 按2×105/孔的密度将GES-1加入12孔板，培养24 h后换不含血清的DMEM培养基继续培养24 h，离心5 min （2 000 r/min，离心半径6.5 cm）收集细胞，加Annexin V-FITC、PI各5 μl，流式细胞仪内检测，分别以Annexin V-FITC及PI单染管为基准参照，荧光倒置显微镜观察并分析GES-1凋亡率。

1.4.4 细胞LDH、SOD活性及MDA含量测定 按1×104/孔的密度将GES-1加入培养皿，收集上清液，刮取GES-1后进行细胞破碎，LDH、SOD活性及MDA含量测定步骤均按试剂盒说明书操作。

1.4.5 Western blotting法 检 测 p-ERK1/2、Bcl-2、Bax表达 GES-1冰上裂解后取上清为总蛋白，BCA法蛋白定量，12%十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）行蛋白电泳，转印蛋白至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，加一抗（1∶1 000）过夜，次日加二抗（1∶2 000）孵育1 h，暗室中加发光液，黑白胶片曝光，Quantity One软件分析条带灰度，计算目的蛋白与内参蛋白β-actin比值。

1.5 统计学方法 采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料以（±s）表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 6组细胞增殖抑制率比较 6组细胞增殖抑制率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中与对照组比较，阿司匹林组、甘草总黄酮低组、甘草总黄酮中组、甘草总黄酮高组、PD98059组细胞增殖抑制率升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与阿司匹林组比较，甘草总黄酮中组、甘草总黄酮高组、PD98059组细胞增殖抑制率降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与甘草总黄酮低组、甘草总黄酮中组、甘草总黄酮高组比较，PD98059组细胞增殖抑制率降低，差异均有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

2.2 6组细胞凋亡率比较 6组细胞凋亡率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中与对照组比较，阿司匹林组、甘草总黄酮低组、甘草总黄酮中组、甘草总黄酮高组、PD98059组细胞凋亡率升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与阿司匹林组比较，甘草总黄酮中组、甘草总黄酮高组、PD98059组细胞凋亡率降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与甘草总黄酮低组、甘草总黄酮中组、甘草总黄酮高组比较，PD98059组细胞凋亡率降低，差异均有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

2.3 6组细胞LDH、SOD活性及MDA含量比较 6组细胞LDH、SOD活性及MDA含量比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；其中与对照组比较，阿司匹林组、甘草总黄酮低组、甘草总黄酮中组、甘草总黄酮高组、PD98059组细胞LDH活性及MDA含量升高、SOD活性降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与阿司匹林组比较，甘草总黄酮中组、甘草总黄酮高组、PD98059组细胞LDH活性及MDA含量降低、SOD活性升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与甘草总黄酮低组、甘草总黄酮中组、甘草总黄酮高组比较，PD98059组细胞LDH活性及MDA含量降低、SOD活性升高，差异均有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

2.4 6组细胞p-ERK1/2、Bcl-2、Bax表达比较 6组细胞p-ERK1/2、Bcl-2、Bax表达比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；其中与对照组比较，阿司匹林组、甘草总黄酮低组、甘草总黄酮中组细胞p-ERK1/2表达升高，甘草总黄酮高组、PD98059组细胞p-ERK1/2表达降低，阿司匹林组、甘草总黄酮低组、甘草总黄酮中组、甘草总黄酮高组、PD98059组细胞Bax表达升高、Bcl-2表达降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与阿司匹林组比较，甘草总黄酮中组、甘草总黄酮高组、PD98059组细胞p-ERK1/2、Bax表达降低、Bcl-2表达升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与甘草总黄酮低组、甘草总黄酮中组、甘草总黄酮高组比较，PD98059组细胞p-ERK1/2、Bax表达降低、Bcl-2表达升高，差异均有统计学意义（P＜0.05，见表3、图1）。

表1 6组细胞增殖抑制率、细胞凋亡率比较（±s，%，n=3）Table 1 Comparison of proliferation inhibition rate and apoptosis rate in GES-1 cells among 6 groups

表1 6组细胞增殖抑制率、细胞凋亡率比较（±s，%，n=3）Table 1 Comparison of proliferation inhibition rate and apoptosis rate in GES-1 cells among 6 groups

注：与对照组比较，aP＜0.05；与阿司匹林组比较，bP＜0.05；与甘草总黄酮低组比较，cP＜0.05；与甘草总黄酮中组比较，dP＜0.05；与甘草总黄酮高组比较，eP＜0.05

组别 细胞增殖抑制率 细胞凋亡率对照组 0 4.31±2.09阿司匹林组 41.94±4.05a 45.82±6.38a甘草总黄酮低组 40.52±4.16a 44.61±5.93a甘草总黄酮中组 33.13±5.07ab 33.72±5.17ab甘草总黄酮高组 22.37±4.49ab 26.02±6.06ab PD98059组 14.26±3.36abcde 14.96±4.29abcde F值 22.036 38.785 P 值 ＜0.01 ＜0.01

表2 6组细胞LDH、SOD活性及MDA含量比较（±s，n=3）Table 2 Comparison of LDH and SOD activities，and MDA content in GES-1 cells among 6 groups

表2 6组细胞LDH、SOD活性及MDA含量比较（±s，n=3）Table 2 Comparison of LDH and SOD activities，and MDA content in GES-1 cells among 6 groups

注：LDH=乳酸脱氢酶，SOD=超氧化物歧化酶，MDA=丙二醛；与对照组比较，aP＜0.05；与阿司匹林组比较，bP＜0.05；与甘草总黄酮低组比较，cP＜0.05；与甘草总黄酮中组比较，dP＜0.05；与甘草总黄酮高组比较，eP＜0.05

组别 LDH（U/L） SOD（U/ml） MDA（μmol/L）对照组 423±81 21.58±2.53 1.28±0.14阿司匹林组 1 297±124a 7.24±1.25a 5.95±0.18a甘草总黄酮低组 1 288±120a 7.29±1.37a 5.89±0.21a甘草总黄酮中组 986±107ab 10.43±1.82ab 3.92±0.23ab甘草总黄酮高组 748±95ab 13.19±2.01ab 2.76±0.15ab PD98059 组 561±93abcde 17.36±2.17abcde 1.98±0.17abcde F值 248.970 139.652 208.606 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

表3 6组细胞p-ERK1/2、Bcl-2、Bax表达比较（±s，n=3）Table 3 Comparison of the protein expressions of p-ERK1/2，Bcl-2 and Bax in GES-1 cells among 6 groups

表3 6组细胞p-ERK1/2、Bcl-2、Bax表达比较（±s，n=3）Table 3 Comparison of the protein expressions of p-ERK1/2，Bcl-2 and Bax in GES-1 cells among 6 groups

注：p-ERK1/2=磷酸化细胞外调节蛋白激酶，Bcl-2=B淋巴细胞癌2，Bax=Bcl-2相关X蛋白；与对照组比较，aP＜0.05；与阿司匹林组比较，bP＜0.05；与甘草总黄酮低组比较，cP＜0.05；与甘草总黄酮中组比较，dP＜0.05；与甘草总黄酮高组比较，eP＜0.05

组别 p-ERK1/2 Bcl-2 Bax对照组 0.52±0.07 0.87±0.03 0.23±0.07阿司匹林组 0.89±0.03a 0.34±0.07a 0.82±0.04a甘草总黄酮低组 0.87±0.04a 0.35±0.06a 0.81±0.03a甘草总黄酮中组 0.71±0.05ab 0.48±0.05ab 0.62±0.05ab甘草总黄酮高组 0.43±0.06ab 0.64±0.06ab 0.53±0.06ab PD98059组 0abcde 0.73±0.04abcde 0.34±0.06abcde F值 216.345 138.524 369.236 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

图1 6组细胞p-ERK1/2、Bcl-2、Bax表达电泳图Figure 1 Electrophorogram of the protein expressions of p-ERK1/2，Bcl-2 and Bax in GES-1 cells among 6 groups

3 讨论

阿司匹林是一种常用的解热镇痛药，临床广泛用于治疗风湿病、关节痛，还可抑制血小板聚集，用于预防和治疗脑血栓形成、缺血性心脏病、心绞痛。研究证实长期使用阿司匹林，即使维持低剂量也可造成胃黏膜损伤，诱发溃疡和出血［1］。胃黏膜对于维持胃的正常生理功能起了重要作用，胃黏膜上层分泌的黏液可联结胃黏膜上皮细胞和相邻细胞，从而形成具有保护作用的胃黏膜屏障，防止Na+从黏膜扩散至胃腔内及H+由胃腔逆向扩散至胃黏膜，保护黏膜下层的细胞免受胃液分泌胃酸的腐蚀和胃蛋白酶的消化作用，并抵御细菌及微生物的入侵［9］。既往研究表明阿司匹林可抑制GES-1分泌血小板衍生生长因子AB（platelet-derived growth factor AB，PDGF-AB）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），使GES-1增殖受限，并造成 GES-1损伤［10］。

氧化应激指机体内自由基、活性氧、活性氮产生过多和/或机体抗氧化能力减弱，使活性氧、活性氮清除降低，导致体内活性氧、活性氮增多，破坏了机体内氧化与抗氧化之间的平衡，造成中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，大量氧化产物生成，最终导致组织、细胞氧化损伤的病理过程。氧化应激是自由基在体内产生的负面作用，已成为导致胃黏膜损伤的一个重要因素［11］。脂质过氧化反应和氧自由基反应的协调与动态平衡状态在维持机体正常生理过程中发挥了关键作用，MDA是不饱和脂肪酸的氧化终产物，也是典型的氧化应激生物标志物，其含量的高低可反映机体氧化应激病理过程的损伤程度［12］。SOD是生物体内重要的抗氧化酶，是生物体内清除活性氧，减轻氧化应激损伤的首要物质［13］。LDH是参与糖酵解的重要酶类，细胞受损时LDH可漏出至细胞外液中［14］。本研究结果显示，与对照组比较，阿司匹林处理后，GES-1 LDH活性及MDA含量增加，SOD活性降低，证实阿司匹林可通过氧化应激，诱导GES-1损伤。

GES-1增殖与凋亡的动态平衡在维护胃黏膜屏障功能过程中起了至关重要的作用，此平衡系统的紊乱可诱发胃黏膜溃疡和出血［15］。Bcl-2和Bax在细胞凋亡过程中发挥了调控作用，Bcl-2具有抑制凋亡作用，可以抑制由多种细胞毒因素所引起的细胞凋亡，Bcl-2的过度表达能增强所观察细胞对大多数细胞毒素的抵抗性；Bax是与Bcl-2同源的水溶性相关蛋白，是Bcl-2基因家族中细胞凋亡促进基因，Bax的过度表达可拮抗Bcl-2的保护效应而使细胞趋于凋亡［16］。本研究结果显示，与对照组比较，阿司匹林处理后GES-1凋亡增加，增殖减少，细胞内p-ERK1/2、Bax表达增加，Bcl-2表达降低，证实阿司匹林可通过抑制增殖、调控Bcl-2及Bax表达以促进凋亡，诱导GES-1损伤。

细胞的增殖、凋亡等生命活动均受到机体严格调控，ERK1/2信号通路可被一系列细胞外的刺激信号激活并介导信号从细胞膜向细胞核传导，参与了细胞增殖、分化、侵袭、凋亡、转移等进程［17］。PD98059是非ATP竞争性ERK1/2阻滞剂，能特异性结合ERK1/2并使其失活，阻止Raf对ERK1/2的磷酸化和激活［18］。本研究结果表明，与对照组比较，阿司匹林组GES-1中p-ERK1/2表达显著增加；与阿司匹林组比较，加入甘草总黄酮6、12 mg/L预处理均可显著降低阿司匹林对GES-1增殖的抑制，减少由阿司匹林诱导的GES-1凋亡，降低GES-1 LDH活性及MDA含量并增加SOD活性，增加GES-1中p-ERK1/2及Bax表达，并降低Bcl-2表达；与甘草总黄酮高组比较，加入PD98059预处理可进一步增强甘草总黄酮的上述药理作用，提示甘草总黄酮可通过促增殖、抗凋亡、抗氧化应激等途径减轻阿司匹林诱导的GES-1损伤，其机制可能与抑制ERK1/2信号通路有关。甘草总黄酮对阿司匹林诱导GES-1损伤的保护作用和机制以及甘草总黄酮对于胃黏膜损伤的临床应用需要进一步研究。

综上所述，甘草总黄酮可通过抑制ERK1/2信号通路减轻阿司匹林诱导的GES-1损伤，研究结果有望为甘草总黄酮临床防治阿司匹林引起的胃黏膜损伤提供一定的实验依据。但人体内调控细胞增殖、凋亡等生命活动的信号通路众多，ERK1/2信号通路可能只是其中之一，更深入的机制研究还需要进一步探讨。

作者贡献：李跃文进行实验实施、评估、资料收集、撰写论文、成文；万强进行实验设计与实施、进行质量控制及审校，并对文章负责。

本文无利益冲突。