苦苣菜水提物对小鼠的镇咳、祛痰和抗炎作用观察

王振苗 董丽荣 贾 评 田 慧

(河北北方学院附属第二医院，张家口，075100)

苦苣菜又名苦菜，在我国广泛分布。苦苣菜属植物的主要活性成分是倍半萜类和黄酮类，此外还有香豆素类、甘油酸酯苷类、木脂素类等[1]。该属药用植物及其提取物具有降血糖、降胆固醇、利尿、降压、抗凝血、保肝、抗炎、抗菌、抗肿瘤等多方面的药理作用，同时含有维生素C、维生素B1、B2、胡萝卜素、烟酸等多种维生素，以及铜、镁、铁、锌等多种微量元素，具有很高的营养和药用价值，开发前景十分广阔[2]。特别是近年来，许多实验研究表明该属植物具有抗菌、抗炎作用，可明显抑制动物耳肿、足肿，并能抑制腹腔毛细血管通透性增加。但具体机制研究报道较少，且涉及抗氧化、减少NO生成、抑制凋亡等多个方面，缺乏梳理和阐明，本研究探析苦苣菜水提物对小鼠的镇咳、祛痰和抗炎作用的观察，效果满意，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 昆明种小鼠，体重18～22 g，由内蒙古医科大学实验动物中心提供，合格证号(SCXK(沪)2002-0010)饲养条件:小鼠分开饲养，笼内垫干燥、清洁刨花，温度：18～22 ℃、相对湿度：50～60%、噪声：60 dB以下、换气：8～20次/h、照明：10～14 h，饲料需富含蛋白质、维生素等营养成分。

1.1.2 药物 二甲苯(天津市巴斯夫化工有限公司，国药准字20060812)，碳酸氢钠(天津市四通化工厂，批号:20010209)；苯酚红(天津市凯通化学试剂有限公司，批号：20081006)；地塞米松磷酸钠注射液(山东鲁抗辰欣药业有限公司，批号：09118307)；氯化铵(天津市巴斯夫化工有限公司，批号：20040824)。

1.1.3 仪器 UV-2550紫外分光光度计(日本岛津公司)；台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，电子天平(上海恒华科学仪器有限公司)，分析天平(奥豪斯上海有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 苦苣菜水提物的制备 苦苣菜采自内蒙古医科大学土默特左旗田间，后经内蒙古医科大学生物学教研室鉴定。苦苣菜全草，阴干，剪碎，称取原生药130 g，加适量水浸泡30 min，按照1∶10固液比加水，煎煮60 min，收集滤液I；滤渣加适量水煎煮45 min，得滤液II。合并I、II，经减压浓缩，得1.3 g/mL浓缩液(滤液Ⅲ)100 mL，冷却，置于4 ℃冰箱中备用。

1.2.2 分组与模型制备 二甲苯致耳肿胀模型：末次给药30 min后，于小鼠右后跖皮下注射1%角叉菜胶30 μL致炎，5 h后断头处死小鼠，取血，并从跟骨水平(踝关节中线以下)对称剪下鼠足，称重，以左、右足重量差作为小鼠足肿胀度。根据随机对照法分为正常空白对照组、模型组、苦苣菜水提物剂量I组、苦苣菜水提物剂量II组、苦苣菜水提物剂量III组，每组均为10只，

1.2.3 给药方法 参照“常用动物与人体表面积比值表”，通过换算，确定本次实验采取灌胃给药途径，小鼠的苦苣菜水提物各组给药浓度分别为0.26 g/10 g、0.13 g/10 g、0.065 g/10 g。每次给药前，倍比稀释1.3 g/mL浓缩液，得各剂量组溶液。将小鼠随机分成10组(n=10)，5组进行耳肿实验，其余5组进行足肿实验。耳肿实验中，分别为耳肿模型组、地塞米松2 mg/kg阳性药物组、苦苣菜水提物0.26 g/10 g剂量组、苦苣菜水提物0.13 g/10 g剂量组、苦苣菜水提物0.065 g/10 g剂量组。各组均采用灌胃给药，给药前夜禁食不禁水，给药容量按体重计算0.2 mL/10 g，连续给药5 d。苦苣菜水提物各剂量组分别给予不同浓度的苦苣菜水提物，阳性对照组给予地塞米松磷酸钠注射液2 mg/kg，模型组则分别予以等量生理盐水。

1.2.4 观察指标与方法 1)炎性反应相关因子和炎性介质的含量测定：血清：室温血液自然凝固10～20 min，离心20 min(3 000 r/min)，收集上清，-20 ℃冰箱保存备用。保存过程中如出现沉淀，可再次离心。炎性组织液：整个致炎小鼠足爪称重后，剪碎，放入3 mL 0.9%的生理盐水中，充分浸泡。离心20 min(3 000 r/min，-4 ℃)，制得炎性组织液，-20 ℃冰箱保存备用。应用ELISA试剂盒，分别进行环加氧酶2(COX-2)、P38活化蛋白酶丝裂原(p38MAPK)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)含量的测定。

2)镇咳实验-氨水引咳法：取小鼠18～22 g，除去3 min内未出现咳嗽反应的小鼠，2 d后取50只合格小鼠，根据体重随机分为5组，每组小鼠分布予以0.2 mL/10 g灌胃，空白溶液为生理盐水、模型组、苦苣菜水提液，连续1周；最后一次给药前禁食不禁水12 h，在最后一次给药1 h后，将氨水棉球放置在倒置的圆口烧杯下观察每组小鼠的咳嗽潜伏期和2 min内咳嗽次数(缩胸，腹肌收缩，嘴张大为标准)。

3)祛痰实验-气管酚红法：建立标准曲线：准确称量0.1 g酚红，予以5%碳酸氢钠溶液配制成1000 mL的标准溶液(母液)，在100 mL容器瓶内吸取2.00、1.75、1.25、1.00、0.75、0.50、0.25 mL母液，应用三蒸水稀释至刻度；在546 nm处检测光密度值(OD)分布为0.331、0.295、0.248、0.210、0.169、0.127、0.082，以OD值线性回归酚红溶液浓度，得回归方程；实验方法：取50只小鼠(18～22 g)，根据体重随机分为5组，每组分别灌胃苦苣菜水提液、氯化铵溶液、空白溶液(生理盐水)0.2 mL/10 g，连续1周，最后一次给药前禁食不禁水12 h，最后一次给药1 h后，腹腔注射0.1 mL/10 g 0.5%酚红，酚红注射1 h后，断头处死小鼠，气管周围组织进行剥离，将甲状软骨至气管分支处的一段气管剪下，置于试管内(含有生理盐水2 mL)，再加入0.1 mL5%碳酸氢钠溶液，离心半小时，分离上清液，紫外可见光光度计在546 nm处检测OD值。

4)抗炎实验：二甲苯致耳肿胀法：取小鼠50只(18～22 g)，根据体重随机分为五组，每组小鼠分别灌胃苦苣菜水提液、地塞米松溶液、空白溶液(0.2 mL/10 g)，连续1周，最后一次给药前禁食不禁水12 h，最后一次给药0.5 h后，在小鼠右耳内外两侧均匀涂抹二甲苯，0.02 mL/只；致炎1.5 h后，断头处死小鼠，将小鼠左右耳剪下，在左右耳同一部位应用打孔器打下等大的圆形耳片，称重，肿胀度为右耳重与左耳重的差值；肿胀抑制率=(对照组肿胀度-给药组肿胀度)/对照组肿胀度×100%。比较5组对小鼠的镇咳作用的影响(咳嗽次数、潜伏期)；比较5组对小鼠气管的酚红排泌量、苦苣菜水提物抗二甲苯致小鼠耳肿胀影响；比较不同剂量的苦苣菜水提物环加氧酶2(COX-2)、P38活化蛋白酶丝裂原(p38MAPK)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)含量的变化。

2 结果

2.1 对小鼠的镇咳作用的影响 苦苣菜水提物I组、苦苣菜水提物II组、苦苣菜水提物III组、模型组与空白对照组比较其潜伏期、咳嗽次数均有降低，但苦苣菜水提物III组的咳嗽潜伏期、咳嗽次数显与空白对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 对小鼠的镇咳作用的影响

注:T1/P1为模型组与空白组比较；T2/P2为苦苣菜水提物I组与空白组比较；T3/P3为苦苣菜水提物II组与空白组比较；T4/P4为苦苣菜水提物III组与空白组比较

表2 对小鼠气管的酚红排泌量、苦苣菜水提物抗二甲苯致小鼠耳肿胀影响

注:T1/P1为模型组与空白组比较；T2/P2为苦苣菜水提物I组与空白组比较；T3/P3为苦苣菜水提物II组与空白组比较；T4/P4为苦苣菜水提物III组与空白组比较

2.2 5组对小鼠气管的酚红排泌量、苦苣菜水提物抗二甲苯致小鼠耳肿胀影响 苦苣菜水提物I组、苦苣菜水提物II组、苦苣菜水提物III组、模型组与空白对照组比较，其酚红排泌量均高于空白对照组，但苦苣菜水提物III组的酚红排泌量与空白对照组比较更显著，差异有统计学意义(P<0.05)；苦苣菜水提物I组、苦苣菜水提物II组、苦苣菜水提物III组与空白对照组比较，其抗二甲苯致小鼠耳肿胀均有降低，但苦苣菜水提物III组更显著，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表3 不同剂量的苦苣菜水提物COX-2、p38MARK、TNF-α、IL-6含量的评估比较

注:T1/P1为苦苣菜水提物I组与空白组比较；T2/P2为苦苣菜水提物II组与空白组比较；T3/P3为苦苣菜水提物III组与空白组比较

2.3 不同剂量的苦苣菜水提物环加氧酶2(COX-2)、P38活化蛋白酶丝裂原(p38MARK)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)含量的评估比较 不同剂量的苦苣菜水提物与空白对照组比较COX-2、P38MARK、TNF-α指标均有降低，但苦苣菜水提物III组的临床指标显著低于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

3 讨论

炎性反应是机体在致炎因子作用下所发生的以防御反应为主的病理反应或病理过程。炎性介质是一种生物活性物质，在细胞或体液中产生[3-6]。这些物质通过各种途径作用于血管，引起血管扩张、通透性增加和引起渗出，在炎性反应的发生发展过程中起重要作用。研究药物的抗炎作用，受限必须复制动物模型的炎性反应，一般先选用以血管通透性为主要改变的急性炎性反应模型进行评价。二甲苯致耳肿胀模型是国内比较常用的抗炎机制模型。角叉菜胶致小鼠足肿胀模型是一个急性非感染性炎性反应模型，当给小鼠足跖内注射角叉菜胶时能发生与人体相似的急性炎性反应，如局部毛细血管扩张、血管通透性增高、渗出、水肿等，骨该模型在新药评价中应用十分广泛。该模型具有差异性小，高度重现性等特点[7-8]。

本研究探析苦苣菜水提物对小鼠的镇咳、祛痰和抗炎作用观察，结果显示：苦苣菜水提物I组、苦苣菜水提物II组、苦苣菜水提物III组、模型组与空白对照组比较其潜伏期、咳嗽次数均有降低，但苦苣菜水提物III组的咳嗽潜伏期、咳嗽次数显与空白对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；苦苣菜水提物I组、苦苣菜水提物II组、苦苣菜水提物III组、模型组与空白对照组比较，其酚红排泌量均高于空白对照组，但苦苣菜水提物III组的酚红排泌量与空白对照组比较更显著，差异有统计学意义(P<0.05)；苦苣菜水提物I组、苦苣菜水提物II组、苦苣菜水提物III组与空白对照组比较，其抗二甲苯致小鼠耳肿胀均有降低，但苦苣菜水提物III组更显著，差异有统计学意义(P<0.05)；不同剂量的苦苣菜水提物与空白对照组比较COX-2、P38MAPK、TNF-α、IL-6指标均有降低，但苦苣菜水提物III组的临床指标显著低于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)，与康文艺等[9]的研究结果大体一致，苦苣菜提取物具有显著的抑制作用，且该提取物能够显著减少小鼠的染色皮肤面积和皮肤染料量，当小鼠腹腔毛细血管通透性增加时，该提取物也具有一定的抑制作用，随着提取物含量的变化，小鼠足炎性反应某些衡量参数也具有显著改变；在抗凝血方面，苦苣菜提取物的效果十分明显；本研究结果显示苦苣菜水提物可显著延长氨水诱导的小鼠咳嗽潜伏期，减少咳嗽次数，提示该药具有显著的镇咳功能[10-13]；同时可促进小鼠气管排出酚红量，增加小鼠气管痰液分泌量，且可显著降低COX-2、P38MAPK、TNF-α、IL-6水平，说明苦苣菜提取物具有显著的抗炎作用。综上所述，苦苣菜水提物可不同程度的抑制炎性肿胀，其对急性炎性反应的保护作用可能与下调机体的COX-2、P38MAPK、IL-6、TNF-α等细胞因子和炎性反应介质的释放，以及调节机体有关炎性反应发生通路有关。