穿山龙水提物调控Keap1/Nrf2通路抗CCl4诱导小鼠急性肝损伤作用研究

刘利平 陶旭锋 韩 旭 许丽娜

(1 大连医科大学附属第一医院，大连，116011； 2 大连医科大学药学院，大连，116044)

近年来，肝脏疾病已经成为影响人类健康的最常见疾病之一，寻找有效的防治药物来应对因各种原因所致的肝损伤，也成为目前研究的热点。本研究中采用的四氯化碳(Carbon Tetrachloride,CCl4)诱导肝损伤模型是经典的急性肝损伤模型，并广泛用于保肝药物的筛选。穿山龙(DioscoreaNipponicaMakino)，别名穿山薯蓣，为多年生缠绕草质藤本，其根茎是一种重要的中药材，具有舒筋活络、止咳化痰、祛风止痛等功效。本研究的目是评价穿山龙水提物对小鼠CCl4急性肝损伤的保护作用及其分子机制，为该天然产物的深入研究和开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 昆明小鼠，体重(18～22)g，雄性，由大连医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(辽)2013-0003。

1.1.2 药物 穿山龙药材(购于云南千草源药业有限公司)；水飞蓟素和羧甲基纤维素钠(CMC-Na)(购于Sigma公司)。

1.1.3 试剂与仪器 DAPI、Tris、SDS(购于Sigma公司)；谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒(均购于南京建成生物工程研究所)；谷胱甘肽巯基转移酶(GST)、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)、醌氧化还原酶-1(NQO1)、核因子E2相关因子2(Nrf2)、SOD1、SOD2、血红蛋白加氧酶-1(HO-1)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)一抗及二抗(均购于武汉三鹰生物技术有限公司)；iNOS引物[购于英潍捷基(上海)贸易有限公司]。

AL104电子天平(METTLER TOLEDO，上海)；98-1-B型电子调温电热套(天津市泰斯特仪器有限公司)；R-501旋转蒸发仪(上海科升仪器有限公司)；U-3010紫外可见分光光度计(HITACHI,日本)；DYY-6C型电泳仪(北京市六一仪器厂)；美国UVP凝胶成像系统(BioSpectrum系列，美国)；7500实时定量PCR仪(Applied Biosystems，美国)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 小鼠随机分为对照组(Control)、模型组(Model)、AEDN低剂量组、中剂量组、高剂量组和水飞蓟素阳性对照组，每组10只。小鼠第7天灌胃2 h后，对照组腹腔注射橄榄油，其余各组腹腔注射0.35% CCl4橄榄油溶液建立急性肝损伤模型。

1.2.2 药物提取方法 取穿山龙药材500 g，加入4 000 mL的水，于电热套中加热回流提取。大火煮沸，转小火煮约2 h，药液趁热过滤，滤液备用。以上实验过程重复4次，共制得滤液约15 000 mL。滤液用旋转蒸发仪反复蒸掉水分后，加入约4 200 mL 95%乙醇溶液，混匀，静置24 h。沉淀进一步旋蒸、浓缩后，于真空干燥器中干燥数天成粉末，即为穿山龙水提物(AEDN)，用小型粉碎机磨成粉末状备用。

1.2.3 多糖含量测量方法 采用紫外-可见分光光度法对AEDN中多糖的含量进行测定。首先配制梯度浓度10～200 μg/mL的葡萄糖溶液作为标准品，加入20%苯酚溶液和4 mL浓硫酸显色，以空白试剂作参比，在490 nm处测A值，以吸光度A对葡萄糖标准品浓度C进行线性回归。配制浓度为150 μg/mL的AEDN样品，同法重复测定3次其吸光度值，标准曲线法计算穿山龙多糖含量。

1.2.4 给药方法 称取适量的AEDN和水飞蓟素，溶于0.5% CMC-Na溶液，研磨均匀后用于小鼠灌胃给药。对照组和模型组小鼠灌胃给予0.5% CMC-Na溶液，AEDN低、中、高剂量组小鼠按50 mg/kg、100 mg/kg和200 mg/kg灌胃给予AEDN，水飞蓟素阳性对照组按250 mg/kg灌胃给予水飞蓟素，连续灌胃给药7 d，实验期间各组小鼠正常进食、进水。

1.2.5 检测指标与方法 1)小鼠造模24 h后处死，解剖取肝脏。分别称取各小鼠的肝组织100 mg加入0.9%NaCl溶液匀浆，10 000 r/min离心10 min，取上清液4 ℃冷藏备用。按照试剂盒操作说明书，肝组织匀浆上清液测定其MDA、SOD、GSH和GSH-Px的水平，余下肝组织保存于-80 ℃冰箱。2)采用Western blot法测定各组小鼠肝组织中Keap1、Nrf2、SOD1、SOD2、GST、HO-1和NQO1蛋白的表达。称取于-80 ℃保存的肝组织100 mg，于装有1 mL预冷的RIPA裂解液的EP管中，用组织匀浆机制备肝组织匀浆。待肝组织充分裂解后，10 000 r/min 4 ℃离心10 min，取上清液即为肝组织总蛋白。以BCA蛋白浓度检测试剂盒测定各样本中的蛋白浓度。组织总蛋白稀释至10 μg/μL，与2×loading buffer(100 μl+4 μl β-巯基乙醇)按体积比1∶1混匀，煮沸5 min变性。取50 μg变性后的总蛋白上样，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在120V恒压下电泳，直至溴酚蓝到达胶底部，停止电泳。按湿法转膜将PVDF膜在甲醇中浸泡10 s后，将其和滤纸、凝胶一同放入转移缓冲液中浸泡后一起放入转膜器，冰水浴中，300 mA恒流转膜2～3 h。将载有目标蛋白质的PVDF膜放入5%脱脂奶粉中，摇床上室温封闭3 h。将PVDF膜放入目的蛋白相应的一抗中，4 ℃孵育过夜。取出膜后，以TTBS洗膜3次，10 min/次，再将膜放入二抗中，室温下摇床孵育2 h，TTBS洗膜3次，10 min/次。ECL试剂盒显色，采用动态积分模式进行拍照并用Gel-Pro 4.0软件对蛋白条带进行灰度分析。以GAPDH为内参蛋白，计算Keap1、Nrf2、SOD1、SOD2、GST、HO-1和NQO1的相对表达量。3)采用Real-time PCR法测定各组小鼠肝组织中iNOS mRNA的水平。称取肝组织100 mg，按试剂盒规定方法提取总RNA，以分光光度法测定其浓度后，将总RNA溶液稀释成0.5 μg/μL后按照试剂盒说明书进行逆转录，获得的cDNA保存于-20 ℃冰箱。引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司设计和合成，序列见表1。按照试剂盒操作说明进行Real-time PCR反应。以GAPDH基因作为管家基因，用2-△△Ct法分析肝组织iNOS基因的相对表达。

表1 小鼠相关引物序列

2 结果

2.1 穿山龙水提物的提取率及多糖含量的测定 本实验采用水提取醇沉淀的方法，2 000 g的穿山龙药材共制得192.83 g穿山龙水提物，提取率为19.64%。紫外可见分光光度法测定AEDN中多糖的含量为(53.03±0.70)%。

2.2 AEDN对CCl4诱导肝损伤小鼠肝组织氧化应激指标的影响 本研究测定了AEDN对CCl4诱导小鼠急性肝损伤肝组织中MDA、SOD、GSH和GSH-Px含量的影响，结果如图1所示。小鼠接受CCl4干预后，肝组织损伤导致其中MDA含量显著上升，SOD、GSH和GSH-Px的含量显著下降。给予AEDN(200 mg/kg)后，肝组织中MDA的含量降低(0.70±0.08 nmol/mg protein)，差异有统计学意义(P<0.01)；SOD、GSH和GSH-Px的含量升高，分别升高至(21.15±2.16)U/mg protein、(8.53±1.04)mg/g protein和(73.34±12.21)U，差异有统计学意义(P<0.01)。

图1 AEDN对CCl4作用下的小鼠肝组织生化指标的影响

注:与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05,△△P<0.01

图2 AEDN对CCl4诱导肝损伤小鼠Keap1和Nrf2蛋白表达的影响

注:与对照组比较，*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05,△△P<0.01

图3 AEDN对CCl4诱导下肝损伤小鼠氧化应激信号通路蛋白表达的影响

注:与对照组比较，*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05,△△P<0.01

2.3 AEDN对CCl4诱导小鼠肝损伤Keap1/Nrf2信号通路蛋白的影响 本研究采用Western blot法测定了AEDN对小鼠肝损伤氧化应激信号通路蛋白的影响。如图2所示，模型组中的Keap1蛋白表达升高，差异有统计学意义(P<0.01)、Nrf2蛋白表达下降，差异有统计学意义(P<0.01)，给予AEDN(200 mg/kg)后，Keap1蛋白表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)，Nrf2蛋白表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)。同时，AEDN能够显著上调SOD1、SOD2、GST和NQO1蛋白的表达水平，差异有统计学意义(P<0.01)。见图3。

图4 AEDN对CCl4诱导肝损伤小鼠肝组织iNOS水平的影响

注:与对照组比较，*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较，△△P<0.01

2.4 AEDN对CCl4诱导小鼠肝损伤iNOS的影响 本研究采用了Real-time PCR法测定肝组织iNOS的水平，结果如图4所示，与对照组比较，模型组中iNOS水平显著上调，AEDN 3个剂量均能显著降低肝组织中iNOS mRNA的表达水平，差异有统计学意义(P<0.01)。

图5 苯酚-硫酸显色法的紫外-可见光扫描光谱图

注:A葡萄糖对照品，B穿山龙水提物

3 讨论

AEDN中含有多糖、水、蛋白质和各种盐类等，但因本研究采用了水提醇沉法进行了初步除杂，因此水提物中的主要成分为多糖。图5是葡萄糖对照品和AEDN样品经苯酚-硫酸显色法显色后，进行紫外-可见光扫描的光谱图。由图可以看出，AEDN的紫外扫描图与葡萄糖标准品相似，且最大吸收波长均在490 nm处。因此，AEDN经苯酚-硫酸法显色后，以490 nm作为检测波长。

近年来随着对CC14诱导的急性肝损伤的分子作用机制不断深入和广泛的研究，发现氧化应激是药物对其发挥保肝作用主要分子机制之一[1]。MDA是脂质过氧化的终末降解产物，可与胞质、膜蛋白或某些酶结合成聚合体，损害细胞膜结构，引起肝细胞变性、坏死[2]。急性肝损伤时，肝组织缺血缺氧，脂质过氧化作用增强，MDA水平升高[3]。SOD是由金属辅酶和蛋白质构成的金属酶，SOD1是SOD的最主要亚型，具有抗氧化、抗炎、抗衰老和维护基因组DNA的稳定等功能，同时通过其催化产物H2O2参与调节细胞的生长代谢[4]。SOD2易受促炎性因子、辐射、氧化应激等因素的诱导，继而大量表达，维持线粒体内氧自由基的动态平衡，减轻氧化应激损伤[5]。SOD能特异地与超氧化物阴离子(O-2)发生歧化反应，清除O-2，保护机体不受自由基损害。GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶，特异地催化GSH对过氧化物的还原反应，能清除过氧化物代谢产物，阻断脂质过氧化链锁反应，从而起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。本研究中AEDN降低了肝组织中MDA水平、升高肝组织中SOD、GSH和GSH-Px含量，缓解了急性肝损伤时的氧化应激反应。

为进一步探讨AEDN抗急性肝损伤作用，我们对其作用的分子机制进行了深入研究。在对氧化应激过程中，Keap1/Nrf2是一条重要的调控通路。Keap1是Kelch家族中的一种阻逷蛋白，正常状态下存在于胞质的肌动蛋白细胞骨架上，是Nrf2的负性调节蛋白[6]。Nrf2属于Cap-n-Collar(CNC)调节蛋白家族，是细胞抗氧化应激中的关键转录因子，在生理状态下与胞质中的Keap1结合处于非活性状态。当机体受到其他亲核试剂刺激或处于氧化应激状态时，Nrf2与Keap1解离，Nrf2磷酸化后转入细胞核与抗氧化反应元件(ARE)结合，启动ARE调控的下游Ⅱ相代谢酶及抗氧化蛋白基因的表达，提高机体的抗氧化应激能力[7]。本研究发现AEDN能显著下调肝损伤后肝组织Keap1的蛋白表达，上调Nrf2的蛋白表达。

HO-1、NQO1、GST等是Nrf2下游调控的重要靶蛋白，肝损伤时NQO1、HO-1的表达降低，与Nrf2呈正相关性[8-10]。GST为一种不含硒的GSH-Px，是体内最重要的Ⅱ相代谢酶之一，可保护DNA和蛋白质免受损害，达到解毒目的。GST在肝小叶中分布均匀，且分子量较小，在肝损伤后能快速、特异性的反应肝细胞的损伤状态[11]。血红蛋白加氧酶(HO)是血红蛋白分解代谢的限速酶，HO-1是HO的氧应激诱导型，在急性肝损伤中可被诱导大量表达，一方面通过血红蛋白的3种酶解产物，清除自由基，抗氧化；另一方面，减轻脂质过氧化，降低含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)活性和TNF-α水平，抗细胞凋亡、抗炎，发挥保肝护肝作用[12]。在CC14诱导的急性肝损伤中，HO-1 mRNA的表达下调[13]。NQO1是一种黄素蛋白酶，能以NAD(P)H为电子供体，还原醌类及其衍生物，并使其毒性降低，保护机体的氧化应激损伤，作为Ⅱ相代谢酶之一，在机体的解毒代谢中发挥重要作用[14]。本研究发现AEDN能上调肝损伤后肝组织中SOD1、SOD2、HO-1、NQO1、GST蛋白的表达。

iNOS为一氧化氮合酶(NOS)的诱导型，是产生NO的限速酶。生理状态下NO有一定的保护肝脏的作用，病理状态下，激活后的iNOS产生大量的NO，高浓度NO可引起肝脏损伤，其机制一方面与NO自身的细胞毒性有关，另一方面与NO激活中性粒细胞的粘附作用和氧化应激等有关[15-16]。AEDN显著下调肝损伤所致iNOS mRNA水平的异常增高，缓解氧化应激。

本研究发现AEDN能够显著下调肝组织中MDA水平、iNOS mRNA表达水平和Keap1的蛋白表达，显著上调GSH、GSH-Px、SOD、SOD1、SOD2、HO-1、NQO1、GST和Nrf2的蛋白表达水平。以上结果表明AEDN具有较好的抗CCl4诱导的急性肝损伤作用，这种作用可能是通过调控Keap1/Nrf2信号通路降低氧化应激损伤作用实现的。