染色体微阵列技术在复发性流产病因诊断中的应用*

熊佳丽，王晶，董一善，刘建兵，虞斌，顾建东

（南京医科大学附属常州妇幼保健院1.妇产科，2.实验室，江苏 常州 213000）

自然流产在妊娠人群中的发生率达10%～15%[1]，多为妊娠12周前的早期流产。复发性流产指同一性伴侣连续发生3次及3次以上的自然流产。复发性流产患者随着流产次数的增加，月经失调、宫腔粘连、继发不孕的发生风险不断增加，患者及其家庭的悲伤、焦虑等不良情绪显著增加，故目前普遍认为连续发生2次流产即应当重视并进行评估。自然流产常见的原因包括胚胎染色体异常、免疫失衡、内分泌异常、血栓形成倾向、生殖道畸形或发育不良、生殖道感染及宫颈机能不全等，其中胚胎染色体异常率在早期自然流产中约占50%～60%[2-3]。因此，胚胎或绒毛组织的染色体检测分析对本次自然流产的病因诊断具有重要意义，为今后的生育指导提供重要信息。

染色体微阵列分析（chromosomal microarray analysis, CMA）是一项新兴的以微阵列为基础的染色体分析技术，对全基因组进行扫描，可检出拷贝数变异（copy number variation, CNV）＜1 kb的微缺失和微重复，突破了以往的细胞核型分析只能发现5 mb以上遗传物质改变的技术局限性，且无需组织或细胞培养，避免母体污染，故而将CMA技术应用在自然流产的病因诊断中是很有指导意义的。本研究采用CytoScan 750K基因芯片（美国Affymetrix公司）对61例自然流产患者（流产次数≥2次）的胚胎绒毛组织进行CMA检测分析，探讨CMA技术在复发性流产病因诊断中的临床应用价值，并对夫妻双方再次生育进行遗传风险评估和指导，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2015年9月-2017年6月南京医科大学附属常州妇幼保健院妇科就诊，自然流产次数≥2次，经阴道超声确认胚胎停止发育需行清宫术的孕妇61例，选取无菌清宫术取出的胚胎绒毛组织进行CMA（芯片）检测。患者年龄22～42岁，平均29.9岁；孕周6.43～13周，平均8.86周；流产次数2～4次。所有患者均签署CMA（芯片）检测知情同意书。

1.2 材料与试剂

人类组织DNA提取试剂盒（德国Qiagen公司），NspⅠ酶、T4连接酶、PCR纯化试剂盒、片段化及标记试剂盒、CytoScan 750K（55万个CNV探针+20万个SNP探针）芯片试剂盒（美国Affymetrix公司），PCR扩增试剂盒（美国Clontech公司）。

1.3 仪器与设备

杂交仪Genechip hybridization oven 645、洗涤工作 站GeneChip®Fluidics Station、 扫 描 仪GeneChip®Scanner GCS 3000Dx v.2 System均采用美国Affymetrix公司生产。

1.4 实验方法

无菌清宫术中获取的新鲜胚胎组织，经生理盐水冲洗后，用清洁、锋利的手术剪剪取绒毛组织约20～100 mg，置于装有生理盐水的1.5 ml离心管中，并于1 h内送实验室检测。所有胚胎绒毛组织采用人类组织DNA提取试剂盒提取全基因组DNA。CMA检测均严格按照Affymetrix公司提供的标准流程进行，具体步骤简列如下：取250 ng胚胎绒毛组织DNA经Nsp I酶消化为短片段，将NspⅠ消化产物末端补齐后经T4连接酶连接上共同引物，并进行PCR扩增、纯化，经片段化及标记后与杂交液混合均匀，变性后加载于Cyto Scan 750K芯片并置于杂交仪中50℃ 60 r/min，杂交16～18 h；经洗涤工作站洗脱染色后用扫描仪捕获图像，获取原始数据。

1.5 结果判读

CMA获得的原始数据应用Affymetrix Chromosome Analysis Suite Software 进行分析。参照国际基因组CNV多态性数据库DGV（http：//dgv.tcag.ca/dgv/app/home）、OMIM（http：//www.omim.org）、DECIPHER（http：//decipher.sanger.ac.uk）、ISCA（http：//clinicalgenome.org）等数据库以及相关文献判读CNVs。CMA结果解读报告严格按照美国医学遗传学会对基因芯片拷贝数变异结果解读指南[5]，将CNV分为3个等级：①致病性CNV；②不确定临床意义的CNV；③非致病性CNV。

1.6 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，计数资料采用频数及率表示，比较采用χ2检验或者Fisher确切概率法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 染色体异常的类型及各类型分布

筛选入组的61例自然流产患者胚胎绒毛组织样本进行CMA检测，均获得诊断结果，检测成功率为100%，其中36例样本CMA检测发现异常结果，阳性率59.0%，包括染色体数目异常31例（86.1%），染色体结构异常4例（11.1%），整套染色体单亲二倍体1例（2.7%）。首先，在31例染色体数目异常结果中发现常染色体三体23例、性染色体数目异常3例、嵌合体3例及三倍体2例。本研究中发现的常染色体数目异常中以16三体最为多见，其次为9三体、21三体及22三体；3例性染色体数目异常均为X单体。其次，本研究中发现4例染色体结构异常，包括猫叫综合征1例、Y染色体微缺失1例及2P24.3微重复1例，另有1例12q微重复（780 kb）经数据库查询临床意义不确定，该例患者共自然流产3次，前两次孕2个月经阴道B超均未探及胎心。见表1。

表1 36例自然流产患者胚胎绒毛组织CMA检测异常结果

2.2 染色体异常在不同孕周中的分布情况

61例样本中，以8周前的复发性流产最为多见，占34.4%，经CMA检测，其异常率也最高，达85.7%。同时，流产时间发生越早，胎儿染色体异常率呈增高的趋势。见表2。

2.3 不同年龄阶段的染色异常情况

高龄妇女流产组织染色体数目异常率高达81.8%，高于低龄妇女（81.8% vs 26.0%）（P＜0.05）。见表3。

2.4 流产次数与染色体异常分布情况

61例样本中，流产次数为2次的患者共46例、3次为13例、4次为2例。其中以2次流产中出现染色体异常最为多见，异常率达60.9%，随着流产次数的增加，异常率呈逐渐下降趋势。见表4。

表2 不同孕周染色体异常分布情况

表3 不同年龄阶段染色体异常比较

表4 不同流产次数与染色体核型异常分布情况

3 讨论

CMA这一遗传学诊断技术，最大特点的就是一次检测即能够对整个基因组拷贝数进行高通量、高分辨率、高敏感性扫描和分析，能够精确定位变异区段的位置、清除显示该区段的内的基因含量，并能够对基因进行分析，在基因水平上解释患者的临床表现，并评估预后，故CMA 能够较其他染色体分析技术，能更有效地检出由于染色体导致的流产，并通过对夫妻双方相应位点的检测，对再次生育进行遗传风险评估，具有其他染色体分析技术所无法比拟的优越性[6]。

本研究对61例流产样本进行了CMA检测，成功率达100%。发现染色体异常36例，阳性率为59.0%，其中数目异常31例，占86.1%，是导致胚胎流产的主要原因。绝大多数染色体非整倍体为胚胎期致死性，其中16三体所占比例最高，其次为Turner综合征，9、22和21三体也占较大的比例，而其他染色体三体所占比例较低。非整倍体多数在孕早期发生流产，16三体一般在孕早期流产，少数9、21三体及Turner综合征病例流产可发生于孕中期甚至晚期[2-3，7]。若流产胚胎存在非整倍异常，那么这将是导致流产的根本原因。绝大多数染色体非整倍体为新发或者偶发，因此建议患者自然妊娠，做好常规检查、早中孕筛查、产前诊断。而13、15号染色体和21、22号染色体有发生罗伯逊易位的可能，再发风险高，故建议夫妻双方做核型分析，以排除罗伯逊易位，对再发风险进行评估[8]。孕妇年龄常为染色体数目异常的高危因素，而本组患者年龄＞35岁发生染色体数目异常共21例。因此对染色体数目异常的筛查不应该仅仅关注高龄人群，因为这些异常应该是由于非年龄因素所致。

本研究共检出4例染色体结构异常，占13.8%，远高于以往研究6%的结论[9]，其原因为核型分析分辨率低，对染色体结构异常的检出率远低于CMA。2例样本在染色体发生部分缺失和（或）重复。其中1例检测结果显示：①arr[hg19]5p15.33p15.2（113 576-10 720 924）×110 607 kb致病性变异；②arr[hg19]11p15.5p15.4（230 680-9 273 889）×39 043 kb 致病性变异。该患者染色体在5p15.33p15.2区段有10 607 kb片段缺失，内含8个致病基因，11p15.5p15.4区段有9 043 kb片段重复。其临床表现为：出生后尖锐的猫叫样哭声，智力低下，整体发育迟缓，小头畸形及异常面容，语言发育迟缓，生长发育迟缓，并可能伴有先天性心脏病、神经及肾脏相关的异常和畸形[10-11]。针对此类患者，考虑为流产儿父母双方一方可能为4号、9号染色体的平衡易位的携带者。故建议双方均需行染色体检查，以此来确认胎儿异常的来源并为再次妊娠提供产前诊断依据。

综上所述，CMA技术用于自然流产胚胎组织的染色体分析成功率高，分辨率高，＞5 Mb的CNV亦能检测出，在常规染色体核型分析中很难或不能被发现而导致漏诊；其次CMA检测对标本取材要求远低于传统染色体核型分析技术，不需要活细胞，可以直接提取流产绒毛及死胎组织，能够提供快速、准确的流产物全基因组分析，能够检测染色体数目异常、结构异常、嵌合体等，且无需标本培养。其有效克服了现有其他染色诊断技术的缺点，准确地检验出常规核型能发现的非平衡染色体变异，以后核型技术无法检测到的拷贝数变异，将染色体的诊断水平提高到基因水平，在遗传学分析中表现出明显优势，可以让那些发生复发性流产的患者减少不必要的检查和治疗，为流产病因分析和对夫妻双方再次生育指导提供更有价值的信息。