美托洛尔对急性心肌梗死大鼠心肌损伤及c-fos信号通路的影响

徐燕

（北京王府中西医结合医院 心内科，北京 100049）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction, AMI）是冠状动脉突发持续缺血缺氧而造成的心肌坏死急症，严重影响患者身心健康[1]。有关研究认为[2]，原癌基因c-fos与心血管疾病密切相关，c-fos是细胞响应外界刺激最先表达的基因，其编码蛋白c-fos不能直接发挥作用，只有与c-Jun蛋白结合成激活蛋白转录因子1（activator protein transcription factor-1, AP-1），才能激活靶基因的转录表达。突发心肌缺血时，c-fos能即刻快速表达，它在将刺激转换为胞内信号过程中发挥很重要的作用[3]。MAPK家族成员ERK1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2）是将胞外刺激信号传递到胞内的共同通路，ERK1/2自我磷酸化后可通过磷酸化Elk-1（Ets-like protein-1），进而诱导c-fos的转录[4]。美托洛尔是临床常用选择性β1-受体阻滞药，其能降低心脏做功从而减少心肌需氧，在治疗AMI时，它能有效缓解胸痛，缩小梗死面积，延缓心力衰竭进程，但目前关于美托洛尔治疗AMI的具体作用机制尚不完全明确[5-6]。本研究通过复制AMI大鼠模型，在AMI大鼠服用美托洛尔后检测ERK1、ERK2、c-fos的表达情况，探究美托洛尔减轻AMI大鼠心肌损伤的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SPF级SD雄性大鼠150只，平均体重（328±20）g，购自北京维通利华公司。

1.1.2 主要试剂和仪器 酒石酸美托洛尔（英国阿斯利康制药公司，批准文号：国药准字H32025390）。肝素钠注射液（南京新百药业有限公司，批准文号：国药准字H32025851）。RNA提取试剂盒（美国 Invitrogen公司）。buffer、dNTPs、RNase抑制剂、M-MLV[宝生物工程（大连）有限公司]。蛋白提取试剂（南京凯基生物公司）。c-Fos、ERK1/2、p-ERK1/2兔抗大鼠IgG溶液（一抗溶液）（美国Sigma公司）。碱磷酶标记山羊抗兔IgG溶液（二抗溶液）（美国Sigma公司）。实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）仪（美国Beckman Couhe公司），GIS-2020数码图像分析系统（上海精密仪器仪表有限公司）。

1.2 动物模型复制

本研究参考尹倪等[7]方法复制AMI模型。从150只大鼠中随机取128只复制AMI模型，用1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔麻醉，仰卧固定于手术台后气管插管，连接SAR-830小动物呼吸机（美国CWE公司）辅助呼吸。于胸部4、5肋间开胸，在肺动脉圆锥和左心耳间下方1～2 mm处迅速结扎左冠状动脉前降支，缝合伤口，撤走呼吸机。12导联同步记录心电图仪监测大鼠心电图示Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、aVR、aVL、aVF导联ST段抬高≤0.5 mV，确定复制模型成功。为防止感染，术后3 d内腹腔注射青霉素。剩余22只行假手术，仅在左冠状动脉前降支穿线而不结扎，其他操作同上。

1.3 分组与给药处理

128只大鼠中成功复制90只，死亡38只，将符合AMI模型的90只AMI大鼠随机分为模型组、肝素组及美托洛尔组，每组各30只。另外22只行假手术的大鼠为假手术组。美托洛尔组在术后24 h直接灌胃给予0.1%美托洛尔生理盐水10 mg/（kg·d），肝素组皮下注射给予肝素1 250 u/kg，模型组和假手术组直接灌胃给予等量生理盐水，所有组均为10 ml/kg，1次/d。

1.4 超声心动图检测

术后48 h和4周，将大鼠用1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔麻醉，仰卧固定，采用高分辨率超声仪检测大鼠心率（heart rate, HR）、射血分数（ejection fraction, EF）、短轴缩短率（fractional shortening, FS）、左心室舒张末期内径（left ventricular end-diastolic dimension, LVIDd）、左心室收缩末期内径（left ventricular end-systolic dimension, LVIDs）各值，测量3次，求取平均值。

1.5 心脏标本的处理

术后4周超声检测结束后处死大鼠，剖胸取出心脏，用于制作心脏标本。每组大鼠的心脏标本随机分为两部分：液氮冻存与灌注4%多聚甲醛固定，将心脏标本沿左室长轴垂直方向切成3份，取中间部分制作成Masson病理切片，然后用显微镜图像处理系统扫描切片，依次量取左室截面外周长、瘢痕弧长与内周长，心肌梗死面积（%）=2×瘢痕弧长/（外周长+内周长）×100%。

1.6 TUNEL法检测心肌凋亡细胞

每组剖胸取出心脏后，用PBS洗净血液，浸没于4%多聚甲醛中，过夜，用30%蔗糖使心脏脱水下沉，接着在冷冻下进行切片，TUNEL染色后，用荧光显微镜观察并拍照。

1.7 qRT-PCR检测c-fos、ERK1、ERK2 mRNA表达

以GAPDH作为内参基因，用NCBI Primer Blast设计定量引物序列（由上海生工生物工程股份有限公司合成），引物序列见表1。

表1 引物序列

每组4只液氮冷冻保存的心脏组织，利用Trizol法提取RNA，经琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并用紫外分光光度计检测其纯度及浓度。取1.0μg总RNA，加入 Oligo（dT）1.0μl，加入13μl RNase-free H2O，混匀后，于85℃金属浴中保温5 min使RNA变性，然后放在冰上1 min以防RNA复性；然后继续加入 4.0μl 5×buffer、2.0μl 10 mmol/L dNTPs、0.5μl RNase抑制剂、0.5μl M-MLV，混匀后30℃保温10 min，42℃保温1 h，85℃保温10 min。合成cDNA第一链后，取5μl cDNA（稀释20倍）为模板，加入10μl 2×SYBR Green qPCR Super Mix、0.5μlGAPDH（c-fos、ERK1或ERK2）正反向引物、4.0～20μl ddH2O，在qRT-PCR仪上扩增。反应条件：95℃ 30 s预变性，95℃ 5 s，60℃ 35 s,扩增40个循环。实验进行3次生物学重复。采用 2-ΔΔCt法分析 qRT-PCR 结果，ΔCt=（Ct目的基因-Ct内参基因）±s；ΔΔCt=（ΔCt目的基因-ΔCt内参基因）±s。

1.8 Western blot检测

每组取4只大鼠心脏组织，充分研磨后使用组织蛋白提取试剂提取蛋白质。每组样品取50μl，用Lowry法进行蛋白定量，调节好蛋白浓度；将胞浆蛋白通过SDS-PAGE分离上清液，把分离的蛋白质转印到硝酸纤维素膜上；将膜在1×TBS中浸泡10 min后，在5%牛血清蛋白溶液中封闭1 h，用1×TTBS洗涤2次，接着将膜分别置于在1︰100的c-Fos、ERK1/2、p-ERK1/2兔抗大鼠IgG溶液（一抗溶液）中，4℃孵育过夜；次晨将膜依次用1×TBS、1×TTBS快速清洗后，转移到1︰1 000碱磷酶标记山羊抗兔IgG溶液（二抗溶液）中在室温下孵育2 h，依次用1×TTBS、1×TBS清洗后，用新配制的显色液进行显色，待出现清晰的条带后终止，最后使用GIS-2020数码图像分析系统扫描并分析蛋白杂交条带。

1.9 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0统计软件，计量资料符合正态分布以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，差异有统计学意义后，两组间均数比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 模型成功复制

从150只大鼠中随机取128只复制AMI模型，成功复制90只，死亡38只，且多在复制后24 h内死亡；其余22只大鼠行假手术，死亡2只。将复制成功的90只大鼠随机分为模型组、肝素组和美托洛尔组，每组各30只。AMI大鼠行肉眼观察及心电图检测发现，结扎左冠状动脉前降支后，结扎处下方心肌颜色即刻变浅，局部心肌活动变缓，心电图各肢体导联ST段抬高≤0.5 mV，为复制模型成功的表现。

2.2 美托洛尔对AMI大鼠左心室功能的影响

AMI术后48 h和4周，与假手术组、模型组比较，肝素组和美托洛尔组大鼠心率下降（P＜0.05）。术后48 h，与假手术组比较，模型组、肝素组和美托洛尔组大鼠心脏EF、FS值均下降（P＜0.05）。术后4周，与模型组比较，肝素组和美托洛尔组大鼠心脏EF、FS值均提高（P＜0.05）。术后48 h，与假手术组比较，模型组、肝素组和美托洛尔组大鼠心脏LVIDd、LVIDs均增大（P＜0.05）。术后4周，与模型组比较，肝素组和美托洛尔组大鼠心脏LVIDd、LVIDs均降低（P＜0.05）。美托洛尔组超声心动图各指标与肝素组间的差异无统计学意义（P＞0.05）。假手术组未出现心肌梗死，与模型组比较，肝素组和美托洛尔组大鼠心肌梗死面积减小（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠超声心动图检测结果（±s）

表2 各组大鼠超声心动图检测结果（±s）

注：1）与假手术组比较，P ＜0.05；2）与模型组比较，P ＜0.05

组别 HR/（次/min） EF/% FS/% LVIDd/mm LVIDs/mm 心肌梗死面积/%AMI术后48 h假手术组（n =20） 476.5±20.1 97.1±1.3 63.4±5.3 6.3±0.9 2.0±0.5 0模型组（n =30） 485.2±17.0 65.5±6.91） 31.2±3.11） 7.2±0.71） 4.8±0.71） 58.3±3.11）肝素组（n =30） 413.7±23.91）2） 65.1±8.21） 31.7±4.81） 7.4±1.11） 4.7±0.71） 57.5±4.61）美托洛尔组（n =30） 418.6±25.71）2） 64.9±7.31） 32.1±4.61） 7.3±0.91） 4.7±0.61） 57.1±4.31）F值 80.884 120.165 278.227 6.797 99.214 1 344.926 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 AMI术后4周假手术组（n =20） 491.3±36.5 97.9±1.2 61.8±7.3 6.4±0.8 2.0±0.6 0模型组（n =30） 481.5±25.3 66.1±4.31） 33.1±5.01） 7.1±0.91） 4.7±0.51） 47.1± 5.21）肝素组（n =30） 372.4± 35.61）2） 87.3±6.41）2） 54.2±4.51）2） 6.4±0.92） 3.6±0.81）2） 42.3±4.01）美托洛尔组（n =30） 363.9± 38.11）2） 85.9±6.01）2） 52.4±4.11）2） 6.5±1.12） 3.5±0.61）2） 41.2±4.11）F值 108.626 174.619 150.853 3.661 71.965 643.338 P值 0.000 0.000 0.000 0.015 0.000 0.000

2.3 美托洛尔对AMI大鼠心肌损伤的影响

用显微镜观察Masson染色结果，红色代表正常心肌细胞，蓝色代表胶原纤维。术后4周，假手术组心肌细胞分布整齐，胶原增生不多。与假手术组比较，模型组大鼠心肌梗死边缘的细胞杂乱分布，间质中大量胶原增生，心肌纤维化水平升高。与模型组比较，肝素组和美托洛尔组蓝色胶原减少，心肌纤维化水平降低。见图1。

2.4 美托洛尔对AMI大鼠心肌细胞凋亡的影响

TUNEL结果显示，AMI术后4周，与假手术组比较，模型组大鼠心肌梗死周边细胞的凋亡率增加（P＜0.05）。与模型组比较，肝素组和美托洛尔组大鼠心肌梗死周边细胞的凋亡率降低（P＜0.05）。见图2。

图1 AMI大鼠4周后心肌细胞（Masson染色×200）

图2 美托洛尔对AMI大鼠4周后心肌细胞凋亡的影响

2.5 美托洛尔对AMI大鼠心肌细胞c-fos、ERK1、ERK2 mRNA表达的影响

qRT-PCR结果显示，AMI术后4周，模型组大鼠心肌细胞c-fos、ERK1、ERK2 mRNA表达高于假手术组（P＜0.05）；肝素组、美托洛尔组大鼠心肌细胞c-fos、ERK1、ERK2 mRNA表达低于模型组（P＜0.05）。见图3。

2.6 美托洛尔对AMI大鼠心肌细胞c-fos、ERK1/2及磷酸化ERK1/2蛋白表达的影响

图3 AMI大鼠4周后心肌细胞c-fos、ERK1、ERK2 mRNA表达

Western blot结果显示，AMI术后4周，ERK1/2蛋白表达各组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组大鼠心肌细胞c-fos、p-ERK1/2蛋白表达高于假手术组（P＜0.05）。肝素组、美托洛尔组大鼠心肌细胞 c-fos、p-ERK1/2 蛋白表达低于模型组（P＜0.05）。见图4。

图4 AMI大鼠4周后心肌细胞c-fos、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达

3 讨论

AMI是一种很常见的心血管急症，虽在西方国家最为常见，但其在中国发病率逐年上升。世界卫生组织（WHO）预测，到2020年AMI将成为全球第一大导致死亡原因[8]。临床上常用β-受体阻滞剂治疗AMI，其能拮抗儿茶酚胺与β-肾上腺素受体竞争性结合，从而阻断兴奋和激动的传递[9-11]。美托洛尔作为一种选择性β1-受体阻滞药，在治疗AMI时能降低心脏做功，减少心肌需氧，进而减轻心肌损伤程度[12-13]。本研究发现AMI术后左心室相关指数发生一系列的变化，4周后Masson和TUNEL结果显示：肝素、美托洛尔治疗后心肌蓝色胶原减少，心肌纤维化水平降低，且大鼠心肌梗死周边细胞的凋亡率降低，说明美托洛尔可以缓解AMI大鼠的心肌损伤程度。

c-fos是一种原癌基因，在细胞受到刺激后能即刻最先表达，其编码的核磷蛋白c-fos不能单独起作用，只有与c-Jun蛋白结合成异源二聚体AP-1，才能活化目标基因。c-fos基因在正常的心肌、血管内皮和平滑肌中广泛存在，参与细胞正常的生长发育过程，在应激反应下有一定的组织保护作用，但其过度表达可导致AP-1下游基因肿瘤坏死因子的表达，造成细胞凋亡过度[14-16]。研究发现[17]，c-fos异常表达可能是动脉粥样硬化、心肌肥厚以及高血压的病因之一。大量研究表明[18]，在突发心肌缺血时，c-fos表达上升，转入核内后与c-Jun结合成AP-1调节反向基因表达，将外界信号转换入胞内长时间的细胞行为变化。c-fos启动子区主要有cAMP反应组件（CRE）、血清反应组件（SRE）与sis诱导组件（SIE），MAPK家族成员ERK1/2与细胞的增殖、分化密切相关，是将胞外刺激信号传递到胞内的共同通路，ERK1/2自我磷酸化后可通过磷酸化Elk-1，从而促进三元复合物SRE/SRF/Elk-1的形成，进而诱导c-fos的转录，其中SRF是血清反应因子，因此ERK1/2的表达及磷酸化是c-fos表达的先决条件之一[19-21]。

本研究首先复制AMI大鼠模型，超声显示AMI模型大鼠左心室指数发生显著的变化，qRT-PCR结果显示心肌组织中c-fos、ERK1、ERK2 mRNA的表达增加，这说明AMI后大鼠心脏的左心室出现了重塑现象。AMI大鼠服用肝素、美托洛尔后，与模型组相比，左心室心率降低，相关指数EF、FS、LVIDd、LVIDs发生变化程度较小，心肌组织中蓝色胶原减少，心肌纤维化水平降低，细胞凋亡率下降，同时c-fos、ERK1、ERK2 mRNA表达较低，c-fos蛋白表达水平、ERK1/2的磷酸化水平同样很低，且差异有统计学意义，这说明肝素、美托洛尔可以降低c-fos、ERK1、ERK2的表达及ERK1/2的磷酸化，抑制信号在该通路上的传递。本研究结果进一步表明美托洛尔可减轻AMI大鼠后心肌损伤程度，其作用机制可能与p-ERK1/2-cfos相关途径受到抑制有关。

综上所述，本研究通过结扎大鼠左冠状动脉前降支创建AMI模型，采用美托洛尔治疗后，AMI大鼠的心肌损伤程度减轻，c-fos、ERK1、ERK2的表达水平及ERK1/2的磷酸化水平下降，暗示美托洛尔作用机制可能与p-ERK1/2-c-fos相关途径受到抑制有关。然而AMI大鼠的心肌损伤发生、发展的相关因素很多、相关机制复杂，美托洛尔缓解心肌损伤的作用机制还需继续深入的探究。