炎性受体NOD2在心房颤动病人血小板中的表达意义

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心房颤动是目前临床上最常见的持续性心律失常[1]，房颤是急性心肌梗死的独立危险因素[2]，但机制尚未阐明。血小板在急性心肌梗死的发生发展中起着重要的作用[3]，越来越多的研究证明血小板在炎症与血栓的相互作用中发挥着重要的角色。

NOD2(nucleotide-binding oligomerization domain 2)受体是近年来新发现的表达于血小板内的模式识别受体，在体内炎症的状态下，NOD2受体会激活，进而增强血小板的反应性，引发血栓促进心血管事件的发生[4-5]。炎症在房颤的发生发展中起着重要的作用，房颤是体内的一种炎性状态[6-7]，而血小板炎性NOD2在房颤病人中的表达及意义尚未有研究报道。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2016年6月—2017年6月入住复旦大学附属华山医院心内科的房颤病人80例(房颤组)，并选取同期非房颤病人80例作为对照组，房颤的诊断通过12导联心电图与24 h心电图确诊。排除标准：年龄<18岁或>80岁；有肺部感染、上呼吸道感染、其他部位感染者；正在服用抗炎药物者；肝、肾、造血系统等严重终末期疾病者；妊娠或哺乳期妇女；风湿性疾病或其他自身免疫性疾病者；肿瘤病人；无行为能力者。

1.2 标本的采集与处理 所有入选病人入院第二日清晨采集血标本。抽取肘静脉血3 mL，以3 00 r/min速度离心4 min，获得上清转移至EP管，以700 r/min速度离心8 min，获得血小板沉淀，用1 mL Trizol重悬。提取总RNA，加20 μL 无RNA酶水溶解，按照逆转录试剂说明书(TaKaRa公司， JAPAN) 操作合成cDNA，冻存于-80 ℃。

1.3 荧光定量PCR法检测血小板NOD2 mRNA表达 房颤组与正常对照组血小板cDNA，采用荧光定量PCR方法检测NOD2受体mRNA表达，PCR引物：NOD2-上游：5′-TGGTTCAGCCTCTCACGATGA-3′；下游：5′-CAGGACACTCTCGAAGCCTT-3′；产物长度157bp。GAPDH-上游：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′；下游：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′；产物长度：197bp。PCR建立总体积20 μL 反应体系，反应条件(40个循环)：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60℃ 1 min。每份标本做3个复孔，复孔间Ct值差异控制在0.5以内。目的基因的Ct值减去内参的Ct值作为△Ct，目的基因mRNA表达水平由2-△△Ct表示。

1.4 ELISA法检测炎症因子 炎症指标血清超敏C反应蛋白(hs-CRP)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子(TNF)与白细胞介素-6(IL-6)，通过ELISA法检测，由医院检验科完成。

2 结 果

2.1 房颤组与正常对照组基线资料比较 相较于正常对照组，房颤组左心房较大(P<0.05)，两组在年龄、性别、高血压病、糖尿病、冠心病、心功能不全、吸烟、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、阿司匹林使用、氯吡格雷使用、左室射血分数、白细胞计数、血小板计数与平均血小板体积等基线资料间相比无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

2.2 房颤组与正常对照组血小板NOD2表达水平与相关炎症因子水平比较 与正常对照组相比较，房颤组的炎症指标IL-1β、TNF、IL-6与hs-CRP明显升高(P<0.05)，房颤病人的血小板NOD2 mRNA水平高于正常对照组(P<0.05)。详见表2。

表2 心房颤动组与正常对照组间血小板NOD2表达水平与相关炎症因子水平比较(±s)

2.3 血小板NOD2表达水平与炎症因子之间的相关性分析 入组病人血小板NOD2表达水平与炎症因子之间的相关性分析显示：血小板NOD2 mRNA与炎症因子IL-1β、TNF、IL-6与hs-CRP之间呈正相关，随着IL-1β、TNF、IL-6与hs-CRP水平的升高，血小板NOD2表达水平升高。详见图1。

图1 血小板NOD2表达水平与炎症因子相关性分析

3 讨 论

同Toll样受体一样，NOD2受体是近年来新发现的在血小板内表达的一类模式识别受体，在炎症与免疫中发挥着重要的作用，在炎症状态下NOD2受体会激活，会通过释放炎症因子引起一系列炎症反应。血小板既在血栓的发展中起着作用，又在炎症免疫中发挥重要作用，血小板内NOD2受体激活后可增强血小板的反应性，并且促进血小板炎症因子的释放，促进动脉血栓的形成[6-8]。且越来越多的研究证明NOD2受体活化促进动脉粥样硬化的发生发展[9-10]，促进心血管事件的发生。

高血压病、糖尿病、高脂血症、吸烟等已被明确为急性心肌梗死的危险因素，目前对房颤的关注主要为房颤引起卒中事件的预防[11]，但研究证明对于CHA2DS2-VASc评分为0分或1分的房颤病人，房颤为急性心肌梗死的独立危险因素[2]。所以研究房颤引起急性心肌梗死的机制有重要的临床意义，而血小板在急性心肌梗死的发生发展中起着举足轻重的作用。房颤是一种炎症性疾病，多项研究证实房颤病人的炎症因子表达水平较健康人群显著升高[12-13]。本研究通过对房颤病人炎症指标的检测发现，与正常对照组相比较，房颤病人的炎症指标IL-1β、TNF、IL-6与hs-CRP明显升高。炎症状态下的房颤病人血小板NOD2受体表达水平高于正常对照组，作为炎症反应与血小板活化功能之间的桥梁，NOD2水平有希望成为预防房颤病人发生急性血栓事件的生物学标记。但本研究样本量较小，需要包含血小板活化指标的更大样本量的研究进行进一步证实，房颤病人NOD2水平与血小板活化指标之间的量化关系值得深入探索。此外，关于房颤病人炎症因子升高引起血小板NOD2受体表达水平增高的机制也有待明确。

心房颤动病人血小板NOD2受体表达升高，且与炎症因子水平呈现相关性，NOD2水平可能对房颤病人急性心肌梗死发生具有预测意义。