中药对大鼠心肌细胞凋亡影响的Meta分析

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研究表明，心肌细胞凋亡由氧化应激、负荷过重、缺血、缺氧、再灌注损伤等诱导[1]。凋亡也称为程序化细胞死亡，分为内源性和外源性两条途径。内源性凋亡主要是通过调节 Bcl-2 蛋白家族诱导的，包括Bax、Bcl-2 和Bcl-XL 等信号蛋白。caspase-3作为细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，是细胞杀伤机制的重要组成部分。细胞凋亡是受一系列程序控制并通过信号通路介导的病理过程，阻断其信号通路将有助于阻断凋亡发生。中药对心肌细胞凋亡的影响，单项研究结果受质疑。笔者检索2010年1月—2017年1月的相关文献，运用荟萃分析方法，对中药影响心肌细胞凋亡的有效性进行统计分析，为临床应用提供循证医学证据。

1 资料与方法

1.1 文献检索 计算机检索中国知网(CNKI)、万方数据库，检索时限2010年1月—2017年1月，检索关键词“心肌损伤”“心肌缺血”“Bcl-2”“Bax”“caspase-3”。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准 研究设计：随机对照试验(RCT)，无论是否采用盲法或分配隐藏。研究对象：经心肌损伤处理的SD或Wistar大鼠，雌雄不限。

干预措施：对照组予生理盐水，实验组予中药提取物或中药针剂注射液或中药汤剂。结局指标：Bcl-2、Bax、caspase-3。检测手段：蛋白检测为Western blot法或免疫组化法，mRNA检测为RT-PCR法。

1.2.2 排除标准 综述；结局指标不是计数；资料内容雷同的(同一作者的不同时期文章，但数据相同)；没有检测方法的具体说明。

1.3 结局指标 若研究分组包括空白组、模型组、阳性药物对照组、中药实验组低剂量组、中药实验组中剂量组、中药实验组高剂量组时，以模型组为对照组、中药高剂量组为实验组(中药组)进行Meta分析。

1.4 文献筛选、资料提取 由两位研究者独立按照纳入与排除标准筛选文献和提取资料，如遇分歧，则讨论解决或交由第三方协助裁定。应用Excel工具，自制资料提取表提取资料，提取内容包括：纳入研究的基本信息如研究题目、第一作者、发表时间，随机方法，心肌缺血处理方法，实验分组情况及干预措施，结局指标检测的具体方法，结局指标的数据结果。

1.5 统计学处理 采用Cochrane协作网免费提供的RevMan 5.3(Review Manager)专用软件进行统计分析。计数资料采用均方差(MD)及其95%CI为效应分析统计量，并做森林图。首先应用异质性检验分析各研究间的异质性，然后选用适当的Meta分析模型进行计算与推断。纳入研究结果间的异质性分析采用卡方检验进行分析，检验水准设为P=0.1，即P≥0.1 0时，纳入研究间无异质性时，采用固定效应模型(Fixed Effect Model，FEM)；P<0.10时，纳入研究间存在异质性，采用随机效应模型(Random Effect Model，REM)，并结合I2定量判断异质性的大小。Meta分析的检验水准为α=0.05。

2 结 果

2.1 文献检索结果 通过检索初检出110篇文献，经过查阅文献题目、摘要、全文，获取符合纳入标准的19篇文献。

2.2 纳入文献的基本情况(见表1)

2.3 Meta分析结果

2.3.1 Bcl-2通过Western blot法检测及免疫组化法检测Meta分析结果 对Bcl-2的5项研究通过Western blot法检测，6项研究通过免疫组化法检测。详见图1。各研究间异质性检验：χ2=8 472.23，自由度为10，P<0.000 01，表明11项研究不具有同质性，故应用随机效应模型进行汇总统计量。合并效应量MD=0.46，95%CI[0.25，0.67]，即MD的95%CI上下限均>0，表明11项研究的合并效应量具有统计学意义。合并效应检验：Z=4.36(P<0.000 1)，表明Bcl-2中药组与模型组比较，差异有统计学意义。

2.3.2 Bax通过Western blot法检测及免疫组化法检测Meta分析结果 对Bax3项研究通过Western blot法检测，5研究通过免疫组化法检测。详见图2。各研究间异质性检验：χ2=3 048.07，自由度为7，P<0.000 01，表明8项研究不具有同质性，故应用随机效应模型进行汇总统计量。合并效应量MD=-0.46，其95%CI[-0.60，-0.32]，即MD的95%CI上下限均<0，表明8项研究的合并效应量具有统计学意义。合并效应检验：Z=6.55(P<0.000 01)，表明Bax中药组与模型组比较，差异有统计学意义。

2.3.3 caspase-3通过Western blot法检测及免疫组化法检测Meta分析结果 对caspase-3的7项研究通过Western blot法检测1项研究通过免疫组化法检测。详见图3。各研究间异质性检验：χ2=595.19，自由度为7，P<0.000 01，表明8项研究不具有同质性，故应用随机效应模型进行汇总统计量。合并效应量MD=-0.37，95%CI[-0.50，-0.23]，即MD的95%CI上下限均<0，表明8项研究的合并效应量具有统计学意义。合并效应检验：Z=5.33(P<0.000 01)，表明caspase-3中药组与模型组比较，差异有统计学意义。

表1 纳入文献的基本情况

(续表1)

纳入研究心肌损伤处理方式研究对象及样本量结局指标的检测方法组别结局指标 蛋白蛋白高秋等[]阿霉素致心肌损伤普通级雄性大鼠只免疫印迹法检测蛋白对照组±±模型组±±姜黄素低剂量±±姜黄素中剂量±±姜黄素高剂量±± 罗卫民等[]阿霉素致心肌损伤大鼠只实时定量检测对照组±±阿霉素模型组±±金樱子低浓度组±±金樱子中浓度组±±金樱子高浓度组±± 蛋白蛋白王俊东等[]结扎左前降支清洁级大鼠,雌雄各半 法检测蛋白,半定量法检测空白组±±±±模型组±±±±人参皂苷治疗组±±±± 蛋白(‰) 蛋白(‰)宋春华等[]异丙肾上腺素雄性大鼠只免疫组化法检测蛋白空白组±±模型组±±三七苦碟子提取物低剂量±±三七苦碟子提取物中剂量±±三七苦碟子提取物高剂量±±阳性对照组丹参滴丸±±蛋白()蛋白()桂裕江等[]异丙肾上腺素雄性大鼠只免疫组织化学染色法检测蛋白生理盐水组±±异丙肾上腺素组±±复方丹参片组±±心脑脉络复元汤组±±蛋白蛋白蛋白史丹利[]去甲肾上腺素雄性大鼠只 法检测蛋白正常对照组±±±模型组±±±黄连素低剂量组±±±黄连素中剂量组±±±黄连素高剂量组±±±

(续表1)

纳入研究心肌损伤处理方式研究对象及样本量结局指标的检测方法组别结局指标蛋白邓纯[]异丙肾上腺素大鼠只只, 法检测正常对照组±模型组±黄芪甲甙低剂量组±黄芪甲甙高剂量组± 蛋白金娟等[]阿霉素雄性大鼠只,每组选取只 法检测蛋白,法检测正常对照组±±模型组±±中药对照组±±西药对照组±±参芪益心方高剂量组±±参芪益心方低剂量组±± () () 曹丽梅等[]阿霉素级雄性大鼠只法检测空白组±±±模型组±±±参附注射液组±±±人参附子∶组±±±人参附子∶组±±±人参附子∶组±±± (×) (×)蛋白曹旭丹等[]结扎冠状动脉级雄性大鼠只,每组只,随机取只法测定, 法检测蛋白假手术组±±±模型组±±±低剂量预处理组±±±中剂量预处理组±±±高剂量预处理组±±±蛋白蛋白刘斌等[]阻断左前降支大鼠只,雌雄不限免疫组化法检测蛋白组假手术组±±组缺血再灌注±±组银杏叶提取物±±蛋白蛋白朱智德[]异丙肾上腺素清洁级雄性大鼠 法检测蛋白(=)正常对照组±±模型组±±养心通脉方低剂量组±±养心通脉方高剂量组±±蛋白蛋白郑思道等[]结扎左前降支级雄性大鼠只免疫组化法检测蛋白对照组 ± ± 模型组 ± ± 治疗组(参附) ± ±

图1 中药组与模型组Bcl-2 Meta比较的分析结果

图2中药组与模型组 Bax比较的Meta分析结果

图3 中药组与模型组caspase-3比较的Meta分析结果

2.3.4 BaxmRNA检测结果Meta分析 对Bax 7项研究通过PCR检测。详见图4。各研究间异质性检验：χ2=438.00，自由度为6，P<0.000 01，表明7项研究不具有同质性，故应用随机效应模型进行汇总统计量。合并效应量MD=-0.07，其95%CI为[-0.09，-0.05]，即MD的95%CI上下限均<0，表明7项研究的合并效应量具有统计学意义。合并效应检验：Z=6.00(P<0.000 01)，表明Bax mRNA中药组与模型组比较，差异有统计学意义。

图4 中药组与模型组Bax mRNA检测结果的Meta分析

2.3.5 caspase-3 mRNA检测Meta分析结果 3项研究通过RT-PCR法检测。详见图5。各研究间异质性检验：χ2=203.99，自由度为2，P<0.000 01，表明3项研究不具有同质性，故应用随机效应模型进行汇总统计量。合并效应量MD=-0.30，其95%CI为[-0.61，0.02]，即MD的95%CI上下限均<0，表明3项研究的合并效应量有统计学意义。合并效应检验：Z=1.84(P=0.04)，表明caspase-3mRNA中药组与模型组比较，差异有统计学意义。

图5 中药组与模型组caspase-3 mRNA检测结果比较的Meta分析

2.3.6 Bcl-2 mRNA检测 meta分析结果 各研究间异质性检验：χ2=728.29，自由度为6，P<0.000 01，表明7项研究不具有同质性，故应用随机效应模型进行汇总统计量。合并效应量MD=0.08，其95%CI为[0.06，0.10]，即MD的95%CI上下限均>0，表明7项研究的合并效应量具有统计学意义。合并效应检验：Z=7.76(P<0.000 01)，表明Bcl-2中药组与模型组比较，差异有统计学意义。详见图6。

图6中药组与模型组Bcl-2mRNA检测结果的Meta分析

3 讨 论

心肌细胞缺血再灌注损伤造成的细胞凋亡是导致心肌损伤和心功能下降的重要原因。心肌细胞凋亡在心脏重塑及心力衰竭的病理生理过程中扮演了重要角色，减少心肌细胞凋亡能改善心功能，改善心脏重塑过程[21]。

Bcl家族作为一组结构相似、与线粒体膜稳定性密切相关的家族蛋白，其中Bcl-2为抗凋亡基因，Bax为促凋亡基因。有研究显示：Bcl-2∶Bax<1∶2时细胞发生凋亡，反之则细胞存活。Bcl-2 蛋白是内源性凋亡级联反应的关键调控因子，它通过维持线粒体膜的稳定性抑制凋亡，已被证明与细胞凋亡水平相关[22]。caspase-3作为细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，Bcl-2通过抑制其激活而发挥抗凋亡作用[23]。

中药对心肌细胞凋亡的影响，通过上调Bcl-2、下调caspase-3，抑制缺血再灌注引起的凋亡而发挥作用。但单项研究结果受到质疑。本研究通过荟萃分析发现，中药在抑制心肌细胞凋亡中，3项重要指标Bcl-2、Bax、caspase-3中药组均优于模型组。Bcl-2的Western blot法检测MD=0.64(P<0.000 01)，95%CI为[0.40，0.88]；免疫组化法检测MD=0.12(P<0.000 01)，95%CI为[0.04，0.19]；Bcl-2 mRNA结果MD=0.08(P<0.000 01)，95%CI为[0.06，0.10]。Bax的Western blot法检测MD=-0.81(P<0.000 01)，95%CI为(-1.40，-0.22)免疫组化法检测MD=-0.11(P<0.000 01)，95%CI为[-0.17，-0.04]；Bax mRNA结果MD=-0.07(P<0.000 01)，95%CI为[-0.09，-0.05]。caspase-3的Western blot法检测MD=-0.40(P<0.000 01)，95%CI为[-0.56，-0.24]；免疫组化法检测MD=-0.18(P<0.000 01)，95%CI为[-0.20，-0.16]；caspase-3 mRNA结果合并效应量MD=-0.30(P<0.000 01)，95%CI为[-0.61，0.02]。表明中药组与模型组比较，差异有统计学意义。

经Meta分析可以初步表明，中药通过对凋亡相关基因指标的调节对心肌细胞凋亡起到抑制作用，然而，Meta分析本身存在一定的局限性，有待于更多大规模、多中心的RCT文献入选，以提高荟萃分析的可信度，为指导临床用药提供更好的循证医学证据。