幽门螺杆菌对人组织淋巴瘤细胞的损伤作用及机制

宋光永，张晓荣，郭松佳，高艳萍

(山西医科大学汾阳学院，山西汾阳032200)

幽门螺杆菌(Hp)是一种微需氧型的革兰阴性螺旋杆菌，生存于胃部及十二指肠的各区域内，可引起胃黏膜慢性炎症，促进消化性溃疡和胃恶性肿瘤的发展。研究表明，胃癌的发生与Hp感染呈显著正相关，世界卫生组织和国际癌症研究机构已经将Hp明确定义为Ⅰ级致癌物[1，2]。Hp入侵宿主后，相关炎症因子如人巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、白细胞介素1β(IL-1β)等表达升高，并激活胃黏膜相应的免疫反应，从而刺激单核巨噬细胞消除Hp[3]。人组织淋巴瘤细胞属于单核巨噬细胞，主要通过分泌肿瘤坏死因子、MIF、单核细胞趋化蛋白1等炎症因子产生免疫炎症反应，并通过调节核因子κB(NF-κB)信号通路的重要调节因子，共同抵御Hp对机体的损害[4]。2017年10月，我们采用Hp处理人组织细胞淋巴瘤细胞系U937，观察炎症因子的变化，探讨Hp引起慢性炎症的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 Hp标准菌株由山西医科大学基础医学部馈赠。U937细胞、RPMI1640细胞培养基、胎牛血清购于武汉博士德生物技术有限公司。MIF、IL-1β ELISA试剂盒购于武汉博士德生物技术有限公司；实时荧光定量试剂盒(SYBR Green)、琼脂糖、Taq酶购于北京天根生物技术有限公司；核因子κB抑制蛋白α(IκB-α)、NF-κB p65兔抗人抗体、β-actin抗体、CCK-8试剂盒购于武汉博士德生物技术有限公司。Hp标准菌株由山西医科大学基础医学部馈赠。U937细胞、RPMI1640细胞培养基、胎牛血清和MIF、IL-1β ELISA试剂盒、CCK-8试剂盒以及IκB-α、NF-κB p65兔抗人抗体、β-actin抗体购于武汉博士德生物技术有限公司；实时荧光定量试剂盒(SYBR Green)、琼脂糖、Taq酶购于北京天根生物技术有限公司。

1.2 Hp培养 以93 mL液体哥伦比亚基础培养基、7 mL新鲜脱脂羊血、1 mL混合添加剂制成固体培养基，用接种环将Hp菌株接种到固体培养基上，置入含O2、N2和CO2的混合气袋中，37 ℃培养5 d左右。待水珠针尖样菌体出现后，用接种环轻轻刮下Hp，加入RPMI1640培养基震荡混匀，使用紫外分光光度计测其OD值，1个OD值相当于1×108CFU/mL，得出细菌母液浓度为1.5×109CFU/mL。

1.3 U937细胞培养、分组及Hp干预方法 将细胞加入RPMI1640细胞培养基，37 ℃、5% CO2气体培养箱中培养2 d，待细胞长满后用12孔板进行多孔培养。将细胞随机分为Hp组和对照组。Hp组按细菌与细胞100∶1的比例加入Hp，对照组加入等体积RPMI1640培养液，培养14 h。

1.4 细胞上清中MIF、IL-1β水平检测 采用ELISA法。取两组细胞，离心取上清，检测MIF、IL-1β水平。按试剂盒说明书以标准品绘制标准曲线，根据标准曲线计算MIF、IL-1β表达量。采用GraphPad Prism 5软件进行数据分析。

1.5 细胞MIF、IL-1β、IκB-α、NF-κB mRNA检测 采用RT-PCR法。收集两组细胞，采用TRIzol试剂提取细胞RNA。测定纯度及浓度后，置于-80 ℃保存。按照逆转录试剂盒步骤合成cDNA，进行PCR扩增。引物序列：MIF上游5′-GCAGAACCGCTCCTACAGCA-3′，下游5′-GGCTCTTAGGCGAAGGTGGA-3′，扩增片段长度141 bp；IL-1β上游5′-CTTCGAGGCACAAGGCACAA-3′，下游5′-TTCACTGGCGAGCTCAGGTA-3′，扩增片段长度108 bp；IκB-α上游5′-GCTGAAGAAGGAGCGGCTACT-3′，下游5′-TCGTACTCCTCGTCTTTCATGGA-3′，扩增片段长度72 bp；NF-κB上游5′-CACTTATGGACAACTATGAGGTCTCTGG-3′，下游5′-CTGTCTTGTGGACAACGCAGTGGAATTTTAGG-3′，扩增片段长度406 bp；GAPDH上游5′-CCATGTTCGTCATGGGTGTGAACCA-3′，下游5′-GCCAGTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3′，扩增片段长度251 bp。反应条件：95 ℃预变性10 s；55 ℃ 20 s延伸；72 ℃ 30 s，共40个循环。计算Ct值，应用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

1.6 细胞毒性观察 采用CCK-8法。取两组细胞，按100 μL/孔加入96孔板中。加入10 μL CCK-8溶液，放入细胞培养箱内继续培养1 h，用分光光度计测量450 nm处的吸光度OD值，OD值越高代表细胞的毒性越低、细胞的增殖能力越强。

1.7 细胞IκB-α、NF-κB蛋白检测 采用Western blotting法。使用蛋白质提取试剂盒提取细胞中的蛋白，使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。而后进行配胶(分为5%浓缩胶和12%分离胶)、上样、电泳、封闭，以兔抗人IκB-α、NF-κB p65、β-actin抗体为一抗，辣根过氧化物酶酶标标记为二抗，最后加入ECL显色液进行曝光。以蛋白条带的灰度值与β-actin的比值作为检测结果。

2 结果

2.1 两组细胞上清中MIF、IL-1β水平比较 Hp组细胞上清中MIF、IL-1β水平较对照组升高(P均<0.05)。见表1。

表1 两组细胞上清中MIF、IL-1β水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.2 两组细胞MIF、IL-1β、IκB-α、NF-κB mRNA表达水平比较 Hp组MIF、IL-1β、IκB-α、NF-κB mRNA表达水平均较对照组均升高(P均<0.05)。见表2。

表2 两组细胞MIF、IL-1β、IκB-α、NF-κB mRNA表达水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05，△P<0.01。

2.3 两组细胞毒性比较 Hp组和对照组细胞的OD值分别为0.17±0.00、0.41±0.05，Hp组较对照组活细胞数量减少，细胞毒性增强(P<0.01)。

2.4 两组细胞NF-κB p65、IκB-α蛋白表达比较 Hp组细胞NF-κB p65、IκB-α蛋白表达水平均较对照组升高(P均<0.05)。见表3。

表3 两组细胞NF-κB p65、IκB-α蛋白表达比较

注：与对照组比较，*P<0.05，△P<0.01。

3 讨论

Hp是一种微需氧性质的革兰阴性弯状杆菌，宽0.5～1 μm、长2.5～5 μm，细胞柱上的鞭毛能促进其自身的流动，并造成宿主黏膜损伤。目前关于Hp如何逃脱免疫监视导致慢性感染和炎症的机制仍未完全阐明[5]。Hp作为致癌因子，在Hp感染机体后损害胃及十二指肠黏膜，产生TNF-α、白细胞三烯、IL-1、MIF等，促进黏膜的炎症损伤；随后炎症因子趋化活化的人U937细胞做出及时的免疫防御反应。人U937细胞是机体重要的免疫调节和效应细胞，活化的巨噬细胞分泌细胞因子的量会明显增加，产生TNF-α、MIF、IL-6、IL-1β等，促进机体黏膜的免疫炎症损伤[6]。TNF-α、MIF、IL-1β等炎症因子在慢性炎症的启动中也是必不可少的[7]，MIF、IL-1β、IL-6可以促进结肠和胃黏膜的慢性炎症及后续的癌变过程[8，9]，这些过程主要与STAT1和STAT3的过度激活有关[10]；同时在炎症因子发生作用的时候能够诱导DNA的慢性损伤从而导致机体细胞的凋亡[11]。

目前，关于Hp以及Hp刺激巨噬细胞的研究较多，但有关Hp感染人组织淋巴瘤细胞的研究并不多。Hp作为一级致癌物质，已经引起格外关注。本研究结果显示，Hp组炎症因子MIF、IL-1β的分泌量较对照组增加，表明Hp感染巨噬细胞系U937细胞后，能够促进U937细胞炎症因子MIF、IL-1β分泌，进而诱导机体做出一定的免疫防御反应，间接性抑制菌体对感染者的进一步损害。Hp感染后人U937细胞的毒性增强，这可能与细胞炎症因子分泌量增多有关。Hp组MIF、IL-1β、IκB-α、NF-κB mRNA表达水平均较对照组升高，证实炎症因子表达升高，更进一步说明了细胞毒性升高的原因和机制，即人U937细胞经Hp感染后直接引起了细胞炎症因子分泌量的增加及细胞毒性的加强。

NF-κB是由p50和p65亚基组成的异源性质的二聚体[12]，是正常表达在许多细胞质内的一种重要的多功能核转录因子，其激活后参与许多基因的转录调控，在炎症、免疫反应、氧化应激等过程中发挥重要作用。巨噬细胞中NF-κB信号通路激活后能够诱导炎症因子如IL-1β、MIF、TNF-α等过度表达，使得炎症反应加剧[13]。本研究结果显示，Hp组细胞NF-κB p65、IκB-α蛋白表达水平较对照组升高，表明Hp感染巨噬细胞系U937细胞后，激活了NF-κB信号通路，在此基础上调控Hp对宿主黏膜的免疫炎症损伤。

综上所述，Hp感染人组织淋巴瘤细胞后可诱导MIF、IL-1β等炎症因子分泌增加，加速NF-κB信号通路的激活，进而引起重要信号通路蛋白NF-κB p65、IκB-α表达升高，最终形成一个完备的炎症微环境，扰乱机体的免疫防御反应，导致胃黏膜慢性炎症的发生发展。