肝癌组织中SMARCC1 mRNA表达变化及其对HepG2细胞迁移和侵袭的影响

柯少波，邱虎，石薇，陈佳梅，陈永顺

(武汉大学人民医院，武汉430060)

染色质重塑是指染色质通过动态变化的结构影响基因组DNA、核小体中组蛋白及转录因子，进而调控核内DNA复制、修复和重组，染色质重塑是表观遗传学的一个重要方面[1，2]。染色质重塑复合体SWI/SNF在20%的肝癌患者中存在亚基突变，因此SWI/SNF在肝癌细胞中的发生和发展可能是一种普遍机制[3，4]。文献报道，SWI/SNF复合体包含多个ATP酶相关的亚基，包括SMARCA4、SMARCA2、SMARCB1、SMARCC1等[5]，SWI/SNF亚基突变造成编码蛋白的失活以及复合体功能异常，从而诱发肿瘤发生，可能是一种癌基因。我们的前期研究表明，高迁移率组蛋白B(HMGB1)通过下调靶基因SMARCC1抑制乳腺癌细胞的生存和转移[6]。SMARCC1作为染色质重塑复合体亚基之一，在肝癌发生发展中的作用和机制不明。本研究观察了肝癌组织中SMARCC1的表达变化，然后通过细胞实验观察下调SMARCC1对肝癌细胞迁移、侵袭能力的影响，探讨SMARCC1对肝癌细胞侵袭转移的作用和机制。

1 材料与方法

1.1 临床资料 收集2015年3月～2017年6月在我院行手术治疗的62例肝癌患者，男34例，女28例，年龄(58.7±3.6)岁。AJCC分期Ⅰ期5例，Ⅱ期12例，Ⅲ期26例，Ⅳ期19例。肝功能Child-Pugh分级A级5例，B级32例，C级25例。合并远处转移19例，无远处转移43例。取手术切除的肝癌组织和癌旁组织(距癌组织2 cm以上)，置入液氮保存。本研究经我院伦理委员会批准，患者及家属均签署知情同意书。

1.2 肝癌与癌旁组织中SMARCC1 mRNA表达检测 采用RT-PCR法。取肝癌组织和癌旁组织，加入TRIzol试剂提取组织RNA，逆转录合成cDNA。采用Sybr Green Master Mix(Thermo公司)进行实时PCR。反应条件：94 ℃变性5 min，94 ℃变性40次，15 ℃退火，60 ℃退火1 min。以β-actin作为内参。SMARCC1引物序列：上游5′-GAAGCAGCCAAGCACAGTTTGTAG-3′，下游5′-CAATACCCATGTCAGAGGCAGCA-3′。β-actin引物序列：上游5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3。

1.3 SMARCC1 siRNA设计与合成 利用生物信息学工具选取SMARCC1 siRNA序列为：有义链5′-ACUCAUUGGUUCCUUUAAGGG-3′，反义链5′-CUUAAAGGAACCAAUGAGUCC-3′；阴性对照物序列为：有义链5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反义链5′-ACGUGA-CACGUUCGGAGAATT-3′。SMARCC1 siRNA及阴性对照物由广州锐博生物有限公司合成。采用LipofectamineTMRNAiMAX(美国Invitrogen公司)将SMARCC1 siRNA瞬时转染至HepG2细胞，直接沉默细胞SMARCC1 mRNA表达。

1.4 肝癌细胞分组转染 肝癌HepG2细胞购自武汉大学细胞典藏中心，细胞解冻后加入DMEM(含10%胎牛血清、1%青-链霉素双抗)，置细胞培养箱中培养。取对数生长期细胞，将其分为观察组和对照组，观察组转染SMARCC1-siRNA，对照组转染siRNA阴性对照物。将瞬时转染后的细胞置于6孔板中培养，当细胞达到80%左右融合度时进行后续实验。

1.5 细胞迁移能力观察 采用细胞划痕实验。取两组细胞接种于6孔板中，用100 μL枪头垂直于孔板制作细胞划痕，尽量保持各个划痕宽度一致。用PBS清洗划下的细胞，加入无血清培养基继续培养。于实验0、12 h拍照，采用Image J软件测量划痕宽度，计算细胞迁移率。细胞迁移率=(0 h划痕宽度-12 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。

1.6 细胞侵袭能力观察 采用Transwell实验。向Transwell小室上室中加入稀释后的Matrigel，37 ℃无菌环境下放置1 h。取两组细胞，加入胰蛋白酶消化，制成5×105/mL的细胞悬液，每个小室中加入100 μL细胞悬液，下室中每孔加入500 μL有血清培养基，置于细胞培养箱中培养12 h。取出小室，用棉签擦掉小室内部未穿过底膜的细胞。加入多聚甲醛固定，0.1%结晶紫溶液染色。显微镜下(×200)随机选取8个视野，计数紫色染色的穿膜细胞数。

1.7 细胞中基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)蛋白表达检测 采用Western blotting法。提取细胞总蛋白，配置SDS-PAGE分离胶和浓缩胶，加样，电泳，浓缩胶80 V电泳35 min，分离胶100 V电泳90 min，分离蛋白。采用湿转法将蛋白转至PVDF膜，封闭1 h后，加入一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜；加入二抗孵育1 h，TBST洗膜。化学发光法显影，Image J图像处理软件分析灰度值。

2 结果

2.1 肝癌组织与癌旁组织中SMARCC1 mRNA表达比较 肝癌组织和癌旁组织中SMARCC1 mRNA的相对表达量分别为1.559±0.562、0.468±0.274，肝癌组织中SMARCC1 mRNA表达高于癌旁组织(P<0.01)。

2.2 两组细胞迁移能力比较 观察组细胞迁移率为43.9%±5.6%，对照组为92.5%±6.7%，观察组细胞迁移率低于对照组(P<0.05)。

2.3 两组细胞侵袭能力比较 观察组穿膜细胞数为(26.13±0.89)个，对照组为(76.75±2.64)个，观察组穿膜细胞数少于对照组(P<0.01)。

2.4 两组细胞中MMP-2、MMP-9蛋白表达比较 观察组MMP-2、MMP-9蛋白表达水平均低于对照组(P均<0.05)。见表1。

表1 两组细胞中MMP-2、MMP-9蛋白表达比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

3 讨论

肝癌是多基因、多步骤参与的复杂进展过程[7～9]。近年来，随着分子生物学和基因工程技术的快速发展，肝癌的基因治疗已成为继手术、化疗、介入治疗后具有巨大前景的治疗方式[10]。染色质重塑复合体变异在肝癌中的作用逐渐受到重视，以沉默相应变异基因为突破点，有望开发新型的基因治疗药物。SMARCC1是染色质重塑复合体亚基之一，在多种肿瘤发展中起关键作用[11]。本研究结果显示，SMARCC1在肝癌组织中呈高表达，表明SMARCC1与肝癌的发病有关。

Wang等[12]研究表明，SMARCC1在乳腺癌、前列腺癌中均呈高表达，且细胞实验表明，内源性的高表达促进了肿瘤细胞的增殖和侵袭。Heebøll等[13]研究表明，SMARCC1在前列腺癌组织中呈高表达，SMARCC1表达与前列腺癌复发、淋巴转移及病理Gleason分级呈正相关。Iwagami等[14]研究表明，miR-320c通过抑制靶基因SMARCC1促进胰腺癌细胞的活性，并逆转了人胰腺癌耐药细胞系MiaPaCa2的耐药性。本研究通过下调肝癌细胞的SMARCC1 mRNA表达，观察其对细胞迁移和侵袭能力的影响，结果表明，肝癌细胞的迁移和侵袭能力受到抑制。这与以往SMARCC1在其他恶性肿瘤中的研究结果相吻合。因此认为，SMARCC1可能是一种癌基因，参与肝癌的侵袭转移。

MMP异常高表达是肿瘤侵袭转移的经典机制之一。MMP-2和MMP-9属于MMP家族成员，在肝癌侵袭转移中具有重要意义。MMP-2和MMP-9参与了肿瘤细胞外基质代谢，能降解肿瘤细胞基底膜的Ⅳ型胶原，破坏正常组织结构，从而促进肿瘤细胞的迁移和远处转移。Li等[15]研究表明，转录因子FOXA2能够靶向下调MMP-2基因，从而抑制肝癌侵袭转移。本研究结果显示，下调SMARCC1 mRNA表达后，肝癌细胞中MMP-2、MMP-9蛋白表达水平降低，表明SMARCC1可能介导MMP调控骨肉瘤侵袭能力。

综上所述，肝癌组织中SMARCC1 mRNA表达升高；下调SMARCC1 mRNA表达可抑制肝癌细胞的迁移和侵袭能力，其机制可能与MMP-2、MMP-9表达降低有关。