参苓水煎液对免疫抑制小鼠免疫调节作用的研究
2018-11-13张乔姜苏洋吕航王博涵
张乔，姜苏洋，吕航，王博涵
(1.哈尔滨商业大学,黑龙江 哈尔滨 150076；2.黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040)
中医学关于“正气存内、邪不可干，邪之所凑、其气必虚”的经典论述中，“正气”作为防御外邪入侵的高度功能概括，与现代医学的免疫功能不谋而合。党参在《本草正义》中有“补脾养胃，润肺生津，健运中气，本与人参不甚相远[1]。”茯苓始载于《本草经》，具有健脾补中、养心安神、利水渗湿之效[2]。党参配茯苓，可补气健脾，兼能除湿。现代药理学研究表明，以上两味中药所含多种成分对机体免疫系统、消化系统均具有显著作用。本实验旨在通过上述两味中药对环磷酰胺所致小鼠免疫功能的影响[3]，来确立最显著药效的剂量应用，以期能够为提高机体免疫系统功能提供可参考的量化数据。
1 实验材料
1.1 实验动物
昆明KM小鼠SPF级，雌雄各半，体质量18～22 g。普通级豚鼠，雄性，250～300 g，长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供。雌雄分开喂养，室温(20±2)℃，湿度50%～70%，采用昼夜间断照明，动物自由进食、饮水，适应环境2周。
1.2 实验试剂
环磷酰胺(江苏恒瑞医药有限公司，批准文号：国药准字H32020857)；中华墨汁(哈尔滨泰信墨业有限公司)；绵羊红细胞(北京博尔西科科技股份有限公司，批号161112)；二硝基氟苯(广东惠令化学试剂有限公司，批号160935)；党参、茯苓(哈尔滨世一堂制药厂饮片)。
1.3 实验仪器
WZ-2A微量振荡器(北京海淀电子医疗仪器厂)；TG16A-WS型台式高速离心机(北京医用离心机厂)；UV-9100紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器厂)；微量加样器(德国Eppendor)。
2 方法
2.1 实验方法
将40只小鼠随机分为4组，每组10只，分别为正常对照组(A)、模型对照组(B)、高剂量实验组(C)、低剂量实验组(D)。均灌胃生理盐水0.2 ml/10 g，连续3天。第4天，A组皮下注射生理盐水60 mg/kg，B、C、D组皮下注射环磷酰胺60 mg/kg。然后A、B组灌胃给药生理盐水0.2 ml/10 g，连续3天，C组灌胃给药水煎液0.2 ml/10 g，连续3天，D组灌胃给药水煎液0.1 ml/10 g，连续3天。
2.2 对免疫器官重量的影响
40只小鼠按上述A、B、C、D组末次给药后1 h，脱颈椎处死，取胸腺和脾脏精密称取湿重。
按照如下公式计算脏器系数：
脏器系数=脏器重量(mg)/体质量(g)
2.3 对单核巨噬细胞的影响
另取40只小鼠按上述A、B、C、D组方法造模,末次给药后1 h，从小鼠的尾静脉注射已稀释的中华墨汁0.05 ml/10 g，注射墨汁后2 min和10 min，分别对小鼠的内眦静脉丛取血20 μL，并且立即将其加到2 ml的0.1% Na2CO3溶液中。以0.1% Na2CO3溶液作为空白对照，用分光光度计在600 nm波长处测定血液样本光密度OD值。然后断颈处死小鼠，取肝脏和脾脏，分别称重[4]。
按照以下公式计算碳廓清指数K，吞噬指数α。
K=(lgC1-lgC2)/(t2-t1)
α=W/WLS×K1/3
K为未经校正的吞噬指数
W为体质量
WLS为肝脾合重
C1为t1(2 min)时血样本的光密度值
C2为t2(10 min)时血样本的光密度值
2.4 对迟发型超敏反应的影响
另取40只小鼠按上述A、B、C、D组灌胃给药,第3天，每组10只小鼠，用硫化钡均匀涂抹腹部皮肤进行脱毛，然后用 DNFB溶液50 μL涂抹致敏。灌胃给药第8天，用DNFB溶液10 μL均匀涂抹于每一组小鼠右耳双面进行致敏攻击。攻击后24 h脱颈处死小鼠，剪下左右耳。用打孔器取下直径 8 mm的耳片，进行称重。用左右耳重量之差反映迟发型变态反应的强弱程度。
2.5 对体液免疫功能的影响
取豚鼠7只进行补体制备，在饲喂前每只心头取血10 ml左右于EP管中，在37℃恒温箱中静置30 min，后置在4℃冰箱内，待血清析出，上离心机，3 000 rpm离心15 min，取上清液。
另取40只小鼠按上述A、B、C、D组灌药第3天，每组取10只小鼠，腹腔注射10%的SRBC致敏，0.2 mL/只，每天给药1次，连续给药4天。致敏后第5天，眼眶内眦静脉丛采血制备血清。将血清样本用生理盐水500倍稀释后，各组样品管中分别加入1∶500试验小鼠血清稀释液1 ml；10% SRBC 0.5 ml、以及1∶10补体血清稀释液1 ml震荡混匀，再另取空白管，分别加入等量的补体、SRBC及1 ml生理盐水。然后将各管置于37℃水浴中孵育10 min，冰浴10 min后终止，2 000 rpm离心10 min，取上清液，在可见光分光光度计540 nm处测定各管OD值，记录结果。
3 结果
3.1 复方水煎剂对免疫器官重量的影响
表1结果显示，模型对照组与正常对照组相比，模型对照组小鼠的脾脏指数、胸腺指数显著降低(P<0.01)。低剂量实验组与模型对照组相比，低剂量实验组小鼠的脾脏指数、胸腺指数在原始数据值上观察有相应的提高，但差异无统计学意义(P>0.05)。高剂量实验组与模型对照组相比，高剂量实验组小鼠的脾脏指数与胸腺指数显著升高(P<0.01，P<0.05)。
表1 复方水煎剂对免疫器官重量的影响
注：与正常组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。
3.2 复方水煎剂对单核巨噬细胞的影响
表2结果显示，模型对照组与正常对照组相比，模型对照组小鼠的吞噬指数K与吞噬系数α显著降低(P<0.01)。低剂量实验组与模型对照组相比，低剂量实验组小鼠的吞噬指数K与吞噬系数α在原始数据值上观察有相应的提高，但差异无统计学意义(P>0.05)。剂量实验组与模型对照组相比，高剂量实验组小鼠的吞噬指数K与吞噬系数α显著升高(P<0.01)。
表2 复方水煎剂对单核巨噬细胞的影响
注：与正常组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。
3.3 复方水煎剂对迟发型超敏反应的影响
由表3结果显示，模型对照组与正常对照组相比，模型对照组小鼠的耳肿胀程度显著降低(P<0.01)。低剂量实验组与模型对照组相比，低剂量实验组小鼠的耳肿胀程度无明显差异(P>0.05)。高低剂量实验组与模型对照组相比，高剂量实验组小鼠的耳肿胀程度显著升高(P<0.01)。
表3 复方水煎剂对迟发型超敏反应的影响
注：与正常组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。
3.4 复方水煎剂对体液免疫功能的影响
由表4结果显示，模型对照组与正常对照组相比，模型对照组小鼠的型对照组小鼠血清中溶血素抗体的含量显著降低降低(P<0.01)。低剂量实验组与模型对照组相比，低剂量实验组小鼠血液中溶血素抗体含量无明显差异(P>0.05)。高低剂量实验组与模型对照组相比，高剂量实验组小鼠血清中溶血素抗体含量显著升高(P<0.01)。
表4 复方水煎剂对体液免疫功能的影响
注：与正常组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。
4 讨论
环磷酰胺(CY)是临床中常用一种免疫抑制剂，可杀死免疫细胞，影响巨噬细胞，同时抑制体液和细胞免疫系统[4-5]。因此CY诱导的免疫抑制小鼠被用来研究药物的免疫调节活性视为经典方法[6]。本研究结果显示，CY对照组小鼠的各项免疫检测指标均低于高、低剂量组(P<0.05)，表明成功建立免疫抑制动物模型。
免疫器官根据发生的时间顺序与功能差异分为中枢免疫器官与外周免疫器官两部分。本实验选择中枢免疫器官中的胸腺与外周免疫器官中的脾脏[7]。因胸腺可训化T细胞，脾脏是体内形体最大的淋巴器官，富含T细胞，且是发生免疫应答的靶向作用点。本实验通过参苓水煎液对免疫抑制模型小鼠免疫器官指数的影响，表明参苓水煎液高低剂量均可使已经处于萎缩状态的免疫器官恢复，并呈现剂量递增趋势。
吞噬作用一般用于评估动物的非特异性免疫状态[8]。巨噬细胞[9]的吞噬作用是最重要的，可防御所有类型的入侵细胞，还可通过分泌细胞因子和处理呈现抗原，间接发挥作用从而调节免疫系统。本实验研究表明，高、低剂量组参苓水煎液能增强腹腔巨噬细胞的吞噬作用，并且高剂量组优于低剂量组。
迟发型超敏反应(DTH)又称为IV型超敏反应，是由单个核细胞浸润与组织细胞损伤为主要特征的反应机体细胞免疫功能的细胞免疫反应。本实验利用二硝基氟苯(dinitrofluorobenzene,DNFB)为致敏原，先于小鼠腹部涂抹致敏，生成致敏淋巴细胞。再于致敏后第6天小鼠耳朵涂抹再次攻击致敏，并于攻击高峰段致敏后24 h进行验证试验。由本实验结果可知环磷酰胺可抑制迟发型超敏反应的进行，高低剂量参苓水煎液均可拮抗环磷酰胺此功能，进而增加迟发型超敏反应的强度。
体液免疫为机体特异性免疫，抗体形成细胞数量的多少可反映体液免疫功能的强弱。以往研究中IgM为体液免疫作用机制中对抗原最具亲和力的抗体[10]，本实验即通过测定溶血素的OD值反映IgM的含量。实验结果显示,高剂量组免疫抑制小鼠的溶血素含量有显著提升，因此提示参苓水煎液可提高免疫抑制模型小鼠的体液免疫功能。
党参有补中益气之效，茯苓具健脾渗湿之功，二者合用，共奏补中健脾之性。脾主运化，为运行中气，滋养四肢百骸之脏。而健运脾阳、补中益气，可提升人体正气和中气，这与现代医学中提高机体免疫力具有相通的作用和性质。本实验将二者有机组合，进行了不同剂量下配伍的免疫系统药理学实验研究，结果显示在传统医学理论指导下的中药药效配伍可为现代医学的免疫系统研究提供样本。
