基于miR-33a调控ABCA1表达探讨血管软化丸抗动脉粥样硬化的作用机制

秦合伟，李彦杰，任锟，张志鑫，邢若星，卢永保

(河南省中医院(河南中医药大学第二附属医院)，河南 郑州 450002)

动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是心脑血管疾病最主要的病理改变基础，目前认为与内皮细胞损伤、脂质紊乱、免疫应答和与其相关的慢性炎症反应有密切关系。AS发病机制和病理的复杂性给临床的治疗和预防带来一定的困难。MicroRNAs(miRNAs)是一类高度保守的非编码小RNA，通过与靶标基因的3′非翻译区(3′UTR)靶向结合而降解靶基因的mRNA，或靶向结合后抑制蛋白质翻译，最终达到调控基因的表达的目的。miR-33a位于固醇调节元件结合蛋白-2(SREBP-2)基因的第16位内含子中，在哺乳动物的体内具有高度保守性，miR-33a的主要靶基因是三磷酸腺苷结合盒A1(ATP binding cassette transporter A1，ABCA1)，ABCA1是介导细胞胆固醇流出的主要膜转运体，既往有研究表明，miR-33a通过抑制ABCA1的表达，减少细胞内胆固醇的流出，导致泡沫细胞的形成[1-3]。本课题组既往研究表明，血管软化丸具有调节血脂，抗炎，抑制动脉粥样硬化的作用。本课题旨在研究血管软化丸调节血脂抑制动脉粥样硬化的作用是否与调控miR-33a，影响ABCA1的表达，促进巨噬细胞内胆固醇流出有关。

1 材料与方法

1.1 实验细胞与动物

单核巨噬细胞(THP-1细胞，中国科学院上海生科院细胞资源中心)；C57BL/6J小鼠(中国科学院上海生命科学研究所)，其中12只作为正常组；ApoE-/-小鼠(南京大学模式动物研究所)，动物许可证号：SCXK(苏)2010-0001),共48只，SPF级，8周龄，体质量(18±2)g，雄性；SD大鼠(上海斯莱克实验动物有限公司)，动物许可证号：SCXK(沪)2003-0003),20只，雄性，体质量(300±20)g。所有动物饲养于河南中医药大学SPF级动物实验中心。

1.2 药物与试剂

血管软化丸，组方：山楂30 g，神曲30 g，莱菔子15 g，陈皮12 g，清半夏9 g，茯苓15 g，连翘12 g，郁金12 g，枸杞子15 g，三七12 g，珍珠30 g，代赭石30 g。所用中药均来源于河南省中医院药剂科，通过医院煎药房煎煮和浓缩成不同浓度的汤剂(血管软化丸高剂量：浓度为3.456 g/mL；血管软化丸中剂量：浓度为1.728 g/mL；血管软化丸低剂量：浓度为0.864 g/mL)。

miR-33a模拟物(miR-33a mimic)购自广州锐博公司；ABCA1兔抗人一抗以及佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)购自Sigma 公司；GAPDH 和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购自杭州贤致公司；总RNA抽提试剂盒、总RNA逆转录试剂盒、ABCA1蛋白定量试剂盒、RT-PCR试剂盒购自TaKaRa公司；RNA逆转录试剂盒购自Fermentas；蛋白提取试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；oxLDL购自广州瑞博生物科技有限公司；其余试剂为国产或进口分析纯。

1.3 血管软化丸含药血清的制备

血清的制备所用SD大鼠40只分为4组，即空白组和血管软化丸的高、中、低3个不同剂量组。空白组给予蒸馏水灌胃，血管软化丸3个剂量组分别给予不同浓度的血管软化丸(高剂量：浓度为3.456 g/mL；中剂量：浓度为1.728 g/mL；低剂量：浓度为0.864 g/mL)灌胃，制取空白、高、中、低4个浓度的含药血清，连续灌胃1周。1周后，腹主动脉取血，12 000 g/min高速离心，取上清液，56℃灭活，-80℃保存备用。

1.4 细胞培养及分组

THP-1细胞加入160 nmol/LPMA培养24 h，使其诱导分化成巨噬细胞后用50 mg/L 的oxLDL孵育，使巨噬细胞变成泡沫细胞，作为本研究的实验模型。THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞换无血清培养基培养，按照实验设计，分为空白组、高剂量组、中剂量组、低剂量组。加处理因素：高、中、低3个浓度的含药血清。

1.5 体内实验

1.5.1 造模与给药

所有小鼠自由饮水，适应性饲养1周后，ApoE-/-小鼠给予高脂饲料(含脂肪21%、胆固醇0.15%)；各组均予以自由饮水。C57BL/6J小鼠12只作为正常组，给予高脂饲料饲养4周后将48只ApoE-/-小鼠按照随机数表法平均分为4组，空白组对照组、高剂量组、中剂量组、低剂量组。对照组给予生理盐水灌胃；中药组分别给予血管软化丸(高剂量：浓度为3.456 g/mL；中剂量：浓度为1.728 g/mL；低剂量：浓度为0.864 g/mL)灌胃。

1.5.2 样品采集与处理

所有要取材动物禁食12 h，采用眼眶取血法采血，按摩心脏部位，用离心管收集血液，低速离心，分离血清，冷冻保存。采血结束后脱颈椎处死，剖腹，分离主动脉(主动脉弓至腹主动脉)，用10%多聚甲醛固定主动脉6 h，主动脉经过乙醇梯度脱水、透明、浸蜡包埋后切片。

1.5.3 病理学切片观察

主动脉经过乙醇梯度脱水、透明、浸蜡包埋后切片，厚度设定为4 μm，采用常规苏木素-伊红(HE)染色法进行切片染色，应用光学显微镜进行观察。

1.5.4 miR-33a、ABCAl基因表达水平的检测

采用实时荧光定量PCR技术，检测各组小鼠主动脉miR-33a、ABCA1基因表达水平。将小鼠主动脉组织称取质量后，加入适量的TRIZOL，按试剂盒说明书提取总RNA。方法同上。采用比较CT值法对样品扩增的CT值进行计算，再按照以下方法计算出各个基因的相对表达量：△CT=目的基因CT-内参CT；△△CT=观察样本△CT-对照样本△CT；样本的相对表达量=2-△△CT，引物序列见表1。

1.5.5 ABCA1蛋白表达水平检测

采用Western blot技术，检测各组小鼠主动脉ABCA1蛋白表达水平。取小鼠主动脉，用PBS冲洗3次，洗去残血，磨碎匀浆后加入蛋白裂解液裂解蛋白，于4℃，1 000×g离心10 min，小心吸取上清液，用BCA法进行蛋白质定量。采用G250-Bradford蛋白浓度测定法对蛋白进行定量。观察ABCA1蛋白质表达的变化，以β-actin蛋白为内参，目的蛋白表达条带密度与β-actin条带密度的比值即为相对表达量[4-5]。

1.6 体外实验

1.6.1 Real-Time PCR技术检测细胞miR-33a表达

用空白血清和高、中、低三个浓度的含药血清处理THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞24 h，或用高剂量组含药血清处理THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞不同时间(0、6、12、24 h)，提取细胞RNA。miR-33a上游引物为： 5-GUUGUUGCUAGUUGCGUUG-3′，下游引物为： 5-GUGUGUAGUUGUUGCAUUG-3′。PCR反应参数：95 ℃ 30 s，1个循环；95 ℃ 5 s，55 ℃ 10 s，40个循环，设U6 为内参，其相对表达量采用△△CT法计算。

1.6.2 Real-Time PCR和Werstern blot技术检测细胞ABCA1表达

空白血清组和含药血清组(高浓度含药血清采用高剂量血管软化丸3.456 g/mL灌胃取血清)，联合处理组(高浓度含药血清+ miR-33a mimic浓度80 nmol/L)。采用含药血清处理后检测，Real-Time PCR检测方法同上。Werstern blot检测方法：用各组血清处理THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞24 h后收集细胞，PBS洗涤3次，用蛋白裂解液裂解总蛋白，提取蛋白，经定量后，加入缓冲液，加热使蛋白质变性，电泳分离蛋白，转膜至PVDF膜上。5%脱脂牛奶室温封闭，加入相应浓度的一抗，4℃孵育过夜，TBST洗涤3次。加入二抗，室温孵育，TBST洗涤3次。用碱磷酶化学发光进行显色。使用ImageJ的软件分析条带灰度值[5]。

1.6.3 油红O染色检测细胞内脂质含量

将细胞接种于48孔板，诱导分化和BPA处理，隔日应用PBS液洗涤3次，采用4%多聚甲醛固定10 min后吸弃培养液，加入固定液；PBS液洗涤3次，加入染色液15 min后，用苏木精染色5 min，10 mL/L HCl 分色，水冲洗至变蓝，双蒸水冲洗后甘油明胶封片。倒置显微镜下观察，可见细胞内脂质呈红染，细胞核呈蓝染，显微镜拍照。

1.6.4 高效液相色谱法检测细胞内胆固醇含量

参照文献方法[3]，收集细胞，加入生理盐水200 μL，冰浴中超声破碎细胞，用BCA 法测定蛋白含量后，加入三氯乙酸(6%)沉淀并去除蛋白，取上清进行胆固醇检测。取100 μL上清液，加入氢氧化钾溶液(8.9 mol/ L) 200 μL，水解胆固醇酯后作为细胞内总胆固醇待测样品。将样品分别与内标液(豆甾醇)混匀，再用正己烷：异丙醇(3：2，V/V)溶液和无水乙醇抽提后真空干燥。上样前用100 μL乙晴-异丙醇(70：30，V/V) 溶解样品，采用C-18柱，温度为室温，流速1 mL/min，检测波长为250 nm，以峰面积定量胆固醇，内标校准，以mg/g细胞蛋白为单位。

1.6.5 [3H]法检测细胞内胆固醇流出

细胞先在正常培养液中和7.4 μGBq×103/L[3H]胆固醇共同孵育24 h，用PBS液洗涤细胞后置含脂蛋白的无血清培养液中再培养24 h。PBS液漂洗细胞3次，加入闪烁液裂解细胞，用液闪计数法检测培养液和细胞中的[3H]胆固醇含量。

胆固醇的流出率(%)=培养液中cpm+总cpm(培养液cpm+细胞cpm)×100%[3]

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 体内实验

2.1.1 一般情况

饲养和灌胃过程中C57BL/6/J小鼠死亡4只(因相互撕咬导致死亡2只，灌胃操作不当导致死亡2只)，ApoE-/-小鼠死亡3只(因相互撕咬导致死亡1只，灌胃操作不当导致死亡2只)，剔除离群值，最后进入统计的各组小鼠数量各为10只。

2.1.2 各组小鼠主动脉病理形态观察

在光学显微镜下发现，正常组：小鼠主动脉壁厚薄均匀，主动脉内膜光滑平整，内膜各层结构正常，未发现明显的动脉粥样硬化病灶。空白对照组：光镜下可见动脉管腔不平，管腔内膜显著增厚；管壁厚度、斑块截面积显著大于正常组。中药三个剂量组：主动脉壁各层结构正常，局部可见小灶性的钙化颗粒物沉积，可见较小斑块，病变程度明显较轻。结果见图1。

注：1.正常组；2.空白对照组；3.高剂量组；4.中剂量组；5.低剂量组。图1 各组小鼠主动脉病理学改变(光学显微镜，200×)

2.1.3 血管软化丸对小鼠主动脉主动脉miR-33a、ABCA1基因和蛋白表达水平的影响

药物干预后，血管软化丸高、中、低三个剂量组小鼠主动脉的miR-33a表达量较空白对照组降低、ABCA1基因和蛋白相对表达量均升高，差异有统计学意义(P<0.01)。结果表明,随着对miR-33a的抑制，ABCA1水平逐渐上升。结果见表2，图2。

表2 血管软化丸对小鼠主动脉主动脉miR-33a、ABCA1基因和蛋白表达水平的影响

注：与正常组比较，*P<0.05；与空白对照组比较，△P<0.05。

图2 各组小鼠主动脉ABCA1蛋白表达

2.2 血管软化丸含药血清对THP-1巨噬细胞毒性的观察

分别用空白、高、中、低4个浓度的血管软化丸含药血清处理THP-1巨噬细胞24 h。采用MTT法检测细胞活力。结果显示，与空白血清处理组相比，高、中、低4个浓度的血管软化丸含药血清处理组细胞活力无明显差异(P>0.05)，结果表明高浓度的血管软化丸含药血清对THP-1巨噬细胞没有明显毒性。见图3。

图3 血管软化丸含药血清对THP-1巨噬细胞毒性的观察

2.3 血管软化丸含药血清对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞miR-33a表达的影响

分别用空白、高、中、低4个浓度的血管软化丸含药血清处理THP-1巨噬细胞24 h。Real-Time PCR检测结果显示，高、中、低4个浓度的血管软化丸含药血清后，细胞中miR-33a表达均下调(P<0.05)，高浓度的血管软化丸含药血清处理组下调最为明显,见图4。随后，用高浓度的血管软化丸含药血清处理THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞不同时间，Real-Time PCR检测结果显示，与空白组相比，处理12 h组细胞miR-33a 表达下调(P<0.05)，处理24 h 组细胞miR-33a表达下调更为明显,见图5。

注：与空白照组比较，*P<0.05。图4 不同浓度含药血清对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞miR-33a表达的影响

注：与空白照组比较，*P<0.05。图5 高浓度含药血清处理THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞在不同时间对miR-33a表达的影响

2.4 各组THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1表达水平

高、中、低浓度血管软化丸含药血清处理后，高浓度的血管软化丸含药血清对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞miR-33a表达下调最为明显，故采用高浓度的血管软化丸含药血清处理THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞，观察其对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1表达水平的影响。

细胞随机分为3组：空白对照组、含药血清处理组、含药血清+80 nmol/L miR-33a mimic联合处理组，处理24 h后，分别提取细胞RNA和蛋白质，采用Real-Time PCR以及Western blot检测。结果显示，与空白对照组相比，含药血清组细胞ABCA1 mRNA和蛋白均明显上调(P<0. 05)；而联合处理组与含药血清单独处理组相比，细胞ABCA1 mRNA和蛋白质均明显下调(P<0. 05)，见表3，图6。提示，当THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞miR-33a过表达后，EGCG上调细胞ABCA1表达的作用被明显抑制。

表3 各组THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1表达水平

注：与空白对照组比较，△P<0.05；与含药血清组比较，▲P<0.05。

图6 各组THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1蛋白表达水平

2.5 miR-33a在血管软化丸含药血清减少THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞脂质蓄积中的作用

油红O结果显示，与空白对照组相比，含药血清单独处理组细胞内红色脂滴明显减少，而加入80 nmol/L miR-33a mimic共同处理后，细胞内的红色脂滴又明显增多，见图7。HPLC检测结果显示，与空白对照组比较，含药血清处理组细胞内总胆固醇、游离胆固醇、胆固醇酯均明显减少；而联合处理组与含药血清处理组相比，细胞内总胆固醇、游离胆固醇、胆固醇酯的含量则明显增加，见表4。

表4 miR-33a在含药血清减少THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞脂质蓄积中的作用

注：与空白对照组比较，△P<0.05；与含药血清组比较，▲P<0.05。

注：A.空白对照组；B.含药血清组；C.联合处理组。图7 miR-33a在血管软化丸含药血清减少THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞脂质蓄积中的作用(200×)

2.6 miR-33a在血管软化丸含药血清促THP-1巨噬细胞源性泡沫胆固醇流出中的作用

与空白对照组相比，含药血清处理使细胞胆固醇流出明显增加(P<0. 05)。而加入80 nmol/L miR-33a mimic共同处理细胞后，血管软化丸含药血清促胆固醇流出作用被明显抑制(P<0.05)，见图8。

注：与空白对照组比较，△P<0.05；与含药血清组比较，▲P<0.05。图8 miR-33a在含药血清促THP-1巨噬细胞源性泡沫胆固醇流出中的作用

3 讨论

动脉粥样硬化作为心脑血管疾病最常见和最基本的病理改变，是一个长期综合性的病理过程，动脉粥样硬化病理机制尚未十分明确，一般认为与患者脂代谢异常、高血压、糖尿病和吸烟等因素有关，关于动脉粥样硬化的发病机制，有脂质侵润学说、血栓形成学说、平滑肌细胞克隆学说、炎症反应学说、免疫细胞(巨噬细胞、T细胞和肥大细胞等)浸润、LDL受体缺失学说、损伤应答学说、剪切应力学说等。

目前，MicroRNAs在脂质代谢中的调节作用日益得到重视，MicroRNAs(miRNAs)是一类高度保守的非编码小RNA，其介导的基因表达是机体内一个广泛存在的基因表达调控方式，miRNA通过与靶标基因的3′非翻译区(3′UTR)靶向结合而降解靶基因的mRNA，或靶向结合后抑制蛋白质翻译，最终达到调控基因的表达的目的。研究显示，miRNA在心血管系统中高度表达，尤其在AS中起重要的作用[6]。研究表明，参与AS脂质代谢的miRNA，包括miR-122、miR-370、miR-378/378、miR-335、miR-27、miR-125a-5p和miR-33等[7]，靶基因包括ABCA1、NPC1、ABCG1、SREBP 和PPARγ等[8]。其中miRNA33通过调控ABCA1表达，影响胆固醇逆向转运在脂质代谢中发挥重要作用。研究表明，在胆固醇平衡的调节中，miR-33通过靶向ABCA1、ABCG1和NPC1发挥作用[9-11]。在人体中存在两种miR-33基因，miR-33b位于第17号染色体SREBP-1基因的17号内含子区域，其宿主基因可选择性调控脂肪酸和三酰甘油的合成；miR-33a是位于SREBP-2基因的第16位内含子中，其宿主基因控制着细胞内的胆固醇合成和摄取，在哺乳动物体内高度保守，其主要靶基因是ABCA1，ABCA1是介导细胞胆固醇流出的主要膜转运体，研究表明，miR-33a可抑制ABCA1表达，减少细胞内胆固醇流出，导致泡沫细胞的形成[3]。随着对动脉粥样硬化的研究日渐广泛和深入，中医药的疗效和优势逐渐受到重视，学术界将热点指向如何综合揭示动脉粥样硬化的发展演变及中药防治动脉粥样硬化的具体作用机制。

中医学认为，大多数慢性病患病日久，往往逐渐出现血瘀之症，即“久病必瘀”，其“瘀”，可以为血瘀亦可为痰瘀互结[12]。追其源流，古人早有论述。《素问痹论》指出：“病久入深，营卫行涩，经络失疏故不同”。朱丹溪曰:“久病必瘀”，叶天士曰：“大凡经主气，以络主血，久病血瘀”。当今社会，民食多以甘美，待客多饮酒酿，嗜烟草者众，“饮食自倍，脾胃乃伤”，加之劳心思虑，郁怒在所难免，因此，病多虚中挟实，治病不宜纯补，宜“寓补于消，以消代补”，消者去其雍也。结合中医基础理论和临床研究，我们认为痰瘀阻滞是动脉粥样硬化的主要证型，李鲤教授创立“血管软化丸”即有此意。血管软化丸由山楂、神曲、莱菔子、陈皮、清半夏、茯苓、连翘、郁金、枸杞子、三七、珍珠、代赭石等12味中药组成[13-14]。方中山楂消食导滞为君药；神曲消食健胃祛除酒食陈腐之积；莱菔子长于下气除胀，消食除积；半夏和茯苓健脾除湿化痰；郁金和三七解郁行气，化瘀散结；枸杞子滋补肝肾以固本；珍珠和代赭石平肝潜阳，降逆祛痰，共为臣药；陈皮理气和中为佐药；甘草调和诸药为使。诸药合用，共奏消积化痰，活血化瘀，平肝潜阳之功。

本实验旨在通过观察血管软化丸是否通过调控miR-33a，进而影响ABCA1的表达，促进巨噬细胞内胆固醇流出，从分子、细胞、组织以及动物水平等多层次揭示中药复方血管软化丸防治AS的分子机制，为AS相关疾病的防治提供新思路。研究结果显示,在不影响细胞活性状况下，血管软化丸含药血清呈浓度和时间依赖性下调miRNA33a表达；血管软化丸含药血清能明显上调ABCA1 mRNA和蛋白的表达，但能被转染miRNA33mimic抑制；血管软化丸含药血清可减少THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞中的脂质蓄积，但能被细胞中转染miRNA33 mimic所弱化；EGCG减少细胞内胆固醇蓄积是与其促进细胞内胆固醇流出有关，细胞中转入过量miRNA33a可以抑制胆固醇流出。病理观察发现,各中药组血管各层结构正常，排列整齐，局部有小灶性的钙化颗粒物沉积，病变轻，斑块小，泡沫细胞和脂质减少，弹力板基本完整，病变程度明显轻于空白对照组。与空白对照组相比，血管软化丸高、中、低3个剂量组小鼠主动脉的miR-33a表达量降低、ABCA1基因和蛋白相对表达量均升高。以上研究结果表明，血管软化丸可通过减少miR-33a的生成，进而上调ABCA1表达，促进巨噬细胞中胆固醇流出，这可能是血管软化丸抗动脉粥样硬化作用的分子机制之一。