香青兰总黄酮对ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化及TGF-β1/Smad通路的影响

信盼 ，王新春 ，，黄川生 ，郭新红 ，袁勇 ，曹文疆 *

（1石河子大学药学院，新疆 石河子 832002；2石河子大学医学院第一附属医院，新疆 石河子 832008）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是心脑血管疾病的重要病理学基础，也是导致心血管疾病患者死亡的重要原因。AS发病机制相对复杂，其具体致病机理尚不清楚。众多研究表明，炎性反应是AS病理形成过程中的关键环节[1-2]，作为AS的基本特征和始动因子，炎性反应可以启动斑块内炎性细胞分泌多种细胞因子，通过不同途经影响斑块的稳定性，从而参与AS的形成与发展[3]。因此，降低炎性因子的表达是治疗AS的一种重要手段。转化生长因子β（TGF-β）是一种具有多种生物学的功能细胞因子，能够调节细胞生长、增殖、分化和迁移，刺激多种细胞因子和炎症介质等活性物质的合成和分泌，并参与细胞外基质合成与降解。研究表明，TGF-β/Smad信号通路在心脑血管疾病中扮演着重要角色，尤其在动脉粥样硬化发生发展过程中发挥着重要作用[4-5]。

香青兰（Dracocephalum moldovicaL.），为唇形科一年生草本植物[6]，是新疆地产植物药，在临床主要用于治疗心绞痛、高血压、动脉粥样硬化及心肌缺血等疾病。香青兰中主要含有黄酮类、挥发油、萜类、氨基酸、微量元素及多肽等化学成分，且黄酮类化合物是其发挥药理作用的主要活性成分[7-8]。课题组前期研究发现，香青兰总黄酮（Dracocephalum moldavicaL.total flavones，TFDM）可通过调节脂质代谢、减轻炎症反应和抑制AngⅡ诱导的血管平滑肌细胞异常增殖和迁移，从而延缓AS的病理进程[9-11]。而对于其抗AS的具体作用机制研究较少。因此，本研究通过高脂饮食诱导载脂蛋白E基因敲除小鼠建立AS模型，在此基础上探讨香青兰总黄酮干预治疗AS的作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级8周龄雄性ApoE-/-小鼠40只及8周龄雄性野生型C57BL/6J小鼠8只，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2016-0011。实验操作均符合医学伦理学标准。

1.2 药物及试剂

香青兰总黄酮（新疆自治区药物研究所，批号20131109），辛伐他汀片（杭州默沙东制药有限公司，批号 M042689），胆固醇（Solarbio，批号 1012E111），小鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）酶联免疫吸附测定试剂盒（批号AK0017OCT19004），小鼠白介素1β（IL-1β）酶联免疫吸附测定试剂盒（批号AK0017OCT19006），小鼠单核细胞趋化蛋白 1（MCP-1）酶联免疫吸附测定试剂盒（批号AK0017OCT19003）及小鼠白介素 6（IL-6）酶联免疫吸附测定试剂盒（批号AK0017OCT19005）均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，RIPA组织细胞裂解液（Solarbio，批号 20150319）；5×蛋白上样缓冲液（Solarbio，批号 P01411/60237），磷酸酶抑制剂混合物（Solarbio，批号 P1260），HRP辣根酶标记山羊抗兔（北京中杉金桥，批号 131879）；HRP辣根酶标记山羊抗小鼠（北京中杉金桥，批号131224），TGF-β1小鼠单克隆抗体（abcam，批号GR212859-1），Smad2/3兔单克隆抗体（abcam，批号GR266690-2），p-Smad2/3兔多克隆抗体（abcam，批号GR52460-10），GAPDH多克隆抗体（武汉三鹰，批号10494-1-AP），ECL 超敏发光试剂盒（Thermo，批号RJ238588）。

1.3 仪器

DB-09型石蜡包埋机（湖北德立森科技有限公司），RM2245半自动石蜡切片机（Leica公司），倒置相差显微镜（日本Olympus公司），DHP-9162电热恒温培养箱（上海齐欣科学仪器有限公司），Sunrise酶标仪（TECAN公司），EPS300电泳仪（Tanon公司），EC3 600凝胶成像仪(美国UVP公司）。

1.4 方法

1.4.1 动物分组

将40只SPF级8周龄雄性ApoE-/-小鼠适应性喂养2周后随机分为5组，每组8只：即模型组（Model，给予相应生理盐水）、香青兰总黄酮低剂量组（TFDM-L，21 mg/kg/d）、香青兰总黄酮中剂量组（TFDM-M，42 mg/kg/d）、香青兰总黄酮高剂量组（TFDM-H，84 mg/kg/d） 和辛伐他汀组（Simvastatin，3.5 mg/kg/d）。8只相同基因背景和周龄的雄性C57BL/6J健康小鼠作为正常对照组（Normal）。

1.4.2 模型建立及取材

正常对照组以普通饲料喂养，模型组、辛伐他汀组和TFDM各给药组以高脂饲料（0.75%胆固醇、15%猪油、84.25%基础饲料）喂养，并每日灌胃相应剂量的药物；所有动物自由饮食饮水，饲养环境维持光照时间 12 h/d，温度（25±2）℃，湿度 45%～65%。连续灌胃干预12周。实验结束前，各组小鼠禁食不禁水12 h，眼球取血，3000 r/min离心10 min，取血清，-20℃保存待用。分离小鼠主动脉根部1 cm固定于4%多聚甲醛中，其余置于-80℃保存待用。

1.4.3 病理形态学检查

主动脉固定完全后进行常规石蜡包埋及连续切片，切片厚度为5 μm。行苏木素-伊红（HE）染色，切片依次经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，酸酒精分化，伊红染色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，最后经中性树脂封片后置于光学显微镜下观察主动脉病理形态的变化。Image-Pro Plus 6.0测算主动脉斑块和管腔面积。

1.4.4 血清 IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α 水平测定

检测各组小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1的水平，具体操作按照ELISA试剂盒说明书进行。

1.4.5 主动脉 TGFβ1、smad2/3、p-smad2/3 蛋白表达的测定

取小鼠主动脉，用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液提取组织蛋白并测定所提蛋白浓度，蛋白样品经上样缓冲液处理后进行10%SDS-PAGE凝胶电泳分离，再电印迹转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉或BSA室温封闭2 h，加一抗4℃孵育过夜（GAPDH、TGF-β1、p-Smad2/3和 Smad2/3的稀释比例分别为 1∶5000、1∶1000、1∶500、1∶1000），洗膜3次，加二抗室温孵育1h，洗膜3次，最后用ECL试剂盒显色，凝胶成像仪拍照。以GAPDH为内参，采用Image J软件对条带进行分析。

1.5 统计学分析

采用SPSS 20.0统计学软件统计数据，数据均以均值±标准差（X±S）表示，多组间比较采用单因素方差分析进行统计处理。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 香青兰总黄酮对ApoE-/-小鼠主动脉病理形态学变化的影响

HE染色结果如图1所示，正常组小鼠主动脉内膜完整，无明显平滑肌细胞增生，管腔未明显狭窄，无AS斑块形成。与正常组相比，模型组主动脉内膜平滑肌细胞增生，斑块面积较大，脂质核心大，纤维帽薄，管壁弥漫性增厚并呈现向管腔发展的占位性病变，导致管腔明显狭窄。与模型组相比，TFDM各剂量组和辛伐他汀组可见平滑肌细胞增生，斑块面积较小，脂质核心小，纤维帽厚，血管内膜局部增厚，管腔狭窄程度较轻，病变较局限。说明TFDM可抑制动脉粥样硬化斑块的形成，增强斑块稳定性。

图1 小鼠主动脉组织病理学检查（HE染色×40）Fig.1 Histopathologic examination aorta in mice（HE×40）

2.2 香青兰总黄酮对ApoE-/-小鼠主动脉斑块的影响

由表1可知：各组小鼠主动脉管腔面积无显著性差异（P＞0.05）。与模型组相比，TFDM各剂量组及辛伐他汀组斑块面积与管腔面积比值明显降低，且具有显著性差异（P＜0.05 或P＜0.01），说明 TFDM 可明显减少动脉粥样硬化斑块面积。

表1 不同实验组ApoE-/-小鼠主动脉斑块面积的比较 X± STab.1 Comparison of aortic atherosclerotic plaque area and lumen area of ApoE-/- mice in different groups X± S

2.3 香青兰总黄酮对ApoE-/-小鼠多种炎症因子表达的影响

如图2所示，与正常组相比，模型组血清IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1 浓度显著升高（P＜0.01）。与模型组相比，TFDM低、中、高剂量组和辛伐他汀组血清 IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1浓度显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

说明TFDM可抑制血清中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1的表达，且呈现一定的剂量依赖性变化。

图2 香青兰总黄酮对ApoE-/-小鼠多种炎症因子表达的影响Fig.2 Effects of TFDM on the expression of various inflammatory factors in ApoE-/-mice

2.4 香青兰总黄酮对ApoE-/-小鼠主动脉TGF-β1、p-Smad2/3以及Smad2/3蛋白表达的影响

如图3所示，与正常组相比，模型组主动脉中TGF-β1、p-Smad2/3以及 Smad2/3的蛋白水平显著升高（P＜0.01）。与模型组相比，TFDM 低、中、高剂量组和辛伐他汀组主动脉中TGF-β1、p-Smad2/3以及Smad2/3的蛋白水平显著降低（P＜0.01）。

说明TFFDM可抑制ApoE-/-小鼠主动脉中TGF-β1、p-Smad2/3以及Smad2/3蛋白的表达，且呈现一定的剂量依赖性变化。

图3 各组小鼠主动脉TGF-β1、p-Smad2/3以及Smad2/3蛋白的表达Fig.3 Expression of TGF-β1，p-Smad2/3 and Smad2/3 proteins in the aorta of mice in each group

3 讨论

AS是一种与众多心脑血管疾病危险因素相关的慢性炎症性疾病，常常累及多个脏器，其病变特征是血管内壁有脂质斑块生成，导致管腔内变窄和变硬，进而影响组织供血。本研究采用高脂饮食诱导ApoE-/-小鼠建立AS模型，药物持续干预12周，结果显示，相比于模型组TFDM各剂量组小鼠主动脉斑块面积较小，脂质核心小，纤维帽厚，血管内膜局部增厚，管腔狭窄程度较轻，斑块面积与管腔面积比值显著降低。表明TFDM可通过抑制AS斑块的形成从而延缓AS进程。

AS发病机制十分复杂，存在多种学说，炎症学说是AS发病机制的主流学说。炎性反应贯穿于AS的形成和发展，通过启动斑块内炎性细胞分泌多种细胞因子，而影响斑块的稳定性[3]。因此降低炎性因子的表达，抑制炎症反应是防治AS的重要思路与方向。IL-1β是致AS的重要炎性细胞因子，主要由活化的巨噬细胞、平滑肌细胞和内皮细胞等产生，相关研究表明，IL-1β可促进平滑肌细胞增殖和炎症细胞粘附，诱导基质金属蛋白酶合成，增加血管通透性等[12-14]。IL-6主要由内皮细胞、巨噬细胞及内分泌组织等释放，能够放大急性炎症反应、促使机体产生慢性炎症，并处于中心地位。在AS进程中，IL-6可通过诱导血小板源性生长因子，促进血管平滑肌细胞增殖，增强局部炎症反应。MCP-1是AS形成和发展过程中十分重要的趋化因子，随AS病变程度的加重而升高，是冠心病的独立危险因素之一[15]。MCP-1可通过介导单核细胞向血管损伤部位不断聚集，再侵入内皮进一步分化为巨噬细胞，从而启动及促进AS的进程。其对平滑肌细胞也有趋化增殖作用，并可诱导组织因子表达，促进局部血栓形成。因此，阻断MCP-1作用也是抑制早期血管炎症反应和稳定斑块的重要手段。此外，TNF-α被证实存在于动脉粥样样硬化斑块中，在AS和炎症中发挥作用，并且可以加重脂质代谢紊乱[16]。TNF-α可刺激自身及IL-1、IL-6、细胞黏附分子的表达，发挥促炎作用。在AS的进程中，TNF-α通过促进细胞凋亡和平滑肌增殖，激活血小板黏附和聚集功能，从而增加血栓形成的风险[17]。本实验研究结果显示，相比于模型组，TFDM各剂量组小鼠血清 IL-1β、IL-6、TNF-α及MCP-1表达水平均显著降低。表明TFDM可能通过抑制血清中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α及MCP-1的表达，从而抑制平滑肌细胞增殖，减轻局部炎症反应，延缓AS病理进程。

TGF-β作为一种多功能的细胞因子，对AS进程中动脉内皮的损伤，血管平滑肌的迁移，动脉壁脂质聚集，细胞外基质的沉积和炎性细胞的浸润等关键步骤均有调节作用。在TGF-β家族中，TGF-β1功能最多，活性最强，分布最广，Smad蛋白家族是TGF-β1信号转导的主要分子，介导信号从细胞膜向细胞核的传递[18]。近年来研究发现TGF-β/Smad信号通路参与多种心血管相关疾病的发生与发展，因此成为临床及科研领域的研究热点。据报道，在生理状态下Smad3表达水平较低，TGF-β可抑制血管平滑肌细胞的增生。而在炎症或者损伤后，Smad3水平上调，TGF-β则促进血管平滑肌细胞增生[19]。从而发现TGF-β/Smad信号通路对血管平滑肌细胞可能具有双向调节作用。本实验研究结果显示，模型组主动脉中TGF-β1、Smad2/3以及p-Smad2/3的蛋白水平显著高于正常组，而与模型组相比，TFDM各剂量组TGF-β1、Smad2/3以及p-Smad2/3的蛋白水平明显降低。表明TFDM可能通过抑制TGF-β1及下游蛋白Smad2/3，P-Smad2/3的表达，阻止核转位，从而干预TGF-β1/Smad信号通路的转导，抑制平滑肌细胞的增生和迁移。

综上所述，香青兰总黄酮可能通过抑制炎症反应和干预TGFβ1/Smad信号通路的转导，抑制平滑肌细胞的增殖和迁移，减轻炎症反应，增加斑块的稳定性，从而发挥抗动脉粥样硬化的作用。本研究为探究香青兰总黄酮抗AS作用及其机制提供了新的理论依据。TGF-β具有多种生物学功能，其网络式分子信号通路复杂又庞大，因此，TGFβ/Smad信号在科研及临床领域仍有着广泛的研究空间，并在防治心血管疾病方面有着良好的应用前景。