重组水蛭素的抗血栓形成作用及其机制*

曹文理， 李 菁

(1. 武警后勤学院附属医院呼吸和重症医学科， 2. 武警后勤学院附属医院预防保健科， 天津 300162)

目前公认的血栓形成条件是由Vichow提出的三个条件：即血管内皮细胞损伤、血流状态的改变以及血液凝固性的增加。冷暴露环境下，配合使用血管内皮细胞损伤药物更有助于血栓的形成[1]。中药在临床上具有治疗血栓形成的明确作用，具有增强免疫、抗衰老、抗突变、抗凝血功能[2-3]。活血化瘀中药水蛭分泌的唾液中含有一种由65个氨基酸残基组成的酸性多肽，即水蛭素，这是一种高度特异的凝血酶抑制剂，具有治疗急性心肌梗死、不稳定型心绞痛、肝素相关性血小板减少症，预防深静脉血栓形成的作用，也可用于血液透析过程中的抗凝。目前，基因工程技术的广泛应用，使得重组药物的大量生产成为可能。用基因工程技术合成的重组水蛭素已成为防治各种血栓性疾病的有效药物。本研究选取在冷暴露环境下腹腔注射角叉菜胶诱发的小鼠尾静脉血栓形成模型，研究重组水蛭素抗角叉菜胶引起的尾静脉血栓形成作用并分析其分子机制，为重组水蛭素广泛用于临床提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

重组水蛭素(10 mg/支，含80 mg甘露醇，重庆富进生物医药有限公司)；阿司匹林肠溶片(济南永宁制药股份有限公司)；Ⅰ型角叉菜胶(carrageenan type Ⅰ，Sigma，美国)；凝血酶原时间(prothrombin time，PT)、活化部分凝血激酶时间(activated partial thromboplastin time，APTT)测定试剂盒(北京世帝科学仪器公司)；组织纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator，t-PA)、纤溶酶原激活物抑制剂(type-1 plasminogen activator inhibitor，PAI-1)含量测定试剂盒(上海太阳生物技术有限公司)；6-酮-前列腺素F1α (6-keto-prostaglandin F1α，6-keto-PGF1α)、血栓恶烷B2 (thromboxane B2，TXB2) 放射免疫分析试剂盒(北京普尔伟业生物科技有限公司)；Flex Station3酶标仪(Molecular Devices，美国)；KS604721型放射免疫仪(北京科思佳科技有限责任公司)。阿司匹林溶液的配制：取阿司匹林肠溶片1片，加相应体积的双蒸水，配制成2.5 mg/ml的溶液，4℃保存。

1.2 实验动物分组及给药方法

SPF级雄性昆明小鼠60只，体重(18～22) g，由北京维通利华实验动物中心提供。按体重将小鼠随机分成6组(n=10)：正常组、模型组、阿司匹林组(腹腔注射25 mg/kg)组、重组水蛭素低、中、高剂量组分别腹腔注射重组水蛭素0.05、0.1、0.2 mg/kg。

1.3 尾静脉血栓模型的制备

小鼠在(16～17)℃、相对湿度(30～50)%的环境下，于不加垫料的铁笼中无束缚地适应性饲养3 d。在腹腔注射角叉菜胶造模前24 h与0.5 h，阿司匹林组和重组水蛭素低、中、高剂量组分别腹腔注射阿司匹林25 mg/kg或重组水蛭素0.05、0.1、0.2 mg/kg一次，正常组和模型组小鼠分别腹腔注射等体积生理盐水。然后除正常组外，各组小鼠分别腹腔注射2.5 mg/kg角叉菜胶造模(尾静脉血栓造模成功的判定方法：尾部形成暗红色血栓)[4-5]。造模开始后24 h，阿司匹林组和重组水蛭素低、中、高剂量组再腹腔注射给药1次，正常组和模型组小鼠分别腹腔注射等体积生理盐水。造模48 h后统计血栓长度(从鼠尾末端到形成暗红色血栓前沿的长度)和成栓率[成栓率=(尾部形成暗红色血栓的小鼠数量/本组小鼠样本数量)×100%]。

1.4 PT, APTT及t-PA含量和PAI-1活性的检测

小鼠眼内眦取血0.3 ml(枸橼酸钠抗凝)，以4 000 r/min离心10 min，取上清液。严格按照PT、APTT试剂盒说明书要求进行检测；按照酶联免疫试剂盒操作要求检测t-PA和PAI-1含量。

1.5 TXB2和6-keto-PGF1a含量检测

小鼠眼内眦取血0.3 ml(消炎痛-EDTANa2抗凝)，以4 000 r/min 10 min后，取上清液。按放免分析试剂盒操作要求，分别测定血浆中6-keto-PGF1α及TXB2含量。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 重组水蛭素对角叉菜胶诱导小鼠血栓形成、凝血酶原时间和活化部分凝血活酶时间的影响

正常对照组小鼠尾部均未出现暗红色血栓，模型组和各用药组小鼠尾部均形成暗红色血栓。重组水蛭素低、中、高剂量组血栓长度较模型组明显缩短，差异有统计学意义 (P<0.05，P<0.01)，提示腹腔注射重组水蛭素能明显抑制小鼠尾部血栓的形成(表1)。

与正常对照组相比，模型组小鼠凝血酶原时间(PT)明显缩短(P<0.01)，活化部分凝血激酶时间(APTT)无明显变化。与模型组比较，腹腔注射重组水蛭素低、中、高剂量组小鼠血浆PT均明显延长，差异有统计学意义(P<0.01)，而APTT无明显变化，说明腹腔注射重组水蛭素能明显抑制PT缩短，对APTT无明显影响(表1)。与阿司匹林组比较，重组水蛭素低剂量组小鼠尾部血栓长度明显增加 (P<0.05)，PT明显缩短 (P<0.01)。

ConditionsThe length of thrombosis(mm)PT(s)APTT(s)Control 09.1±0.321.0±1.1Model61.7±8.0**7.4±0.2**21.3±1.6Aspirin46.9±7.5##8.7±0.4##21.1±1.3Hirudin low dose54.7±5.3#Δ8.0±0.4##ΔΔ20.7±1.2Hirudin middle dose52.4±4.1##8.6±0.2##21.0±1.0Hirudin high dose48.8±5.6##8.8±0.3##21.3±1.5

PT: Prothrombin time; APTT: Activated partial thromboplastin time

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group;ΔP<0.05,ΔΔP<0.01vsaspirin group

2.2 重组水蛭素对角叉菜胶诱导小鼠纤溶系统t-PA与PAI-1含量的影响

与正常对照组相比，模型组小鼠t-PA浓度明显下降(P<0.01)，PAI-1浓度明显升高(P<0.01)。与模型组比较，腹腔注射重组水蛭素低、中、高剂量组小鼠血浆t-PA浓度明显升高(P<0.01)，PAI-1浓度明显降低(P<0.01)，提示腹腔注射重组水蛭素能明显抑制t-PA的降低和PAI-1的升高(表2)。与阿司匹林组比较，重组水蛭素低、中剂量组小鼠PAI-1水平明显升高 (P<0.01)。

Conditionst-PA PAI-1 Control2.8±0.35.5±0.3Model1.5±0.2**9.0±0.3**Aspirin2.5±0.2##6.0±0.5##Hirudin low dose2.3±0.2##8.2±0.3##ΔΔHirudin middle dose2.5±0.1##7.4±0.2##ΔΔHirudin high dose2.6±0.2##6.1±0.3##

tPA: Tissue plasminogen activator; PAI-1: Type-1 plasminogen activator inhibitor

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group;ΔΔP<0.01vsaspirin group

2.3 重组水蛭素对角叉菜胶诱导小鼠血浆6-keto-PGF1a与TXB2含量的影响

与正常对照组相比，模型组小鼠血浆6-keto-PGF1a含量明显下降(P<0.01)，TXB2含量明显升高(P<0.01)。与模型组比较，腹腔注射重组水蛭素低、中、高剂量组小鼠血浆6-keto-PGF1a含量明显升高(P<0.01)，TXB2含量明显降低(P<0.01)，提示腹腔注射给予重组水蛭素能明显抑制6-keto-PGF1a的降低和TXB2的升高(表3)。与阿司匹林组比较，重组水蛭素低、中剂量组6-keto-PGF1α水平明显降低(P<0.01，P<0.05)；TXB2水平明显升高 (P<0.01，P<0.05)。

Conditions6-keto-PGF1athromboxane B2Control151.2±10.1272.0±14.7Model105.5±8.1**363.1±18.7**Aspirin149.2±8.7##284.7±22.6##Hirudin low dose133.8±9.9##ΔΔ317.6±10.1##ΔΔHirudin middle dose137.5±11.3##Δ306.3±20.3##ΔHirudin high dose145.3±10.4##299.4±15.3##

TXB2: Thromboxane B2

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group;ΔP<0.05,ΔΔP<0.01vsaspirin group

3 讨论

机体冷暴露后有一个“冷致血管舒张反应(cold-induced vasodilation, CIVD)”，即皮肤血管收缩一定时间后，动-静脉吻合枝突然开放，使皮肤温度回升。皮肤血管舒缩交替使皮肤温度在一定范围内波动，皮肤仍能保持正常结构和功能。如冷暴露超过机体的生理耐受限度，局部血管活动减弱甚至麻痹、血流减少或停滞，就会引起冷损伤，导致血流淤滞、血栓形成。血栓形成与血凝系统、血小板、纤溶系统密切相关。

本实验要求实验小鼠在(16～17) ℃、相对湿度(30～50)%的条件下，在不加垫料的铁笼中无束缚地自由饮水，摄食。由角叉菜胶诱发的小鼠尾静脉血栓形成不仅与角叉菜胶的浓度有关，与小鼠状态、环境温度、湿度均有非常密切的关系[6]。预实验发现，如温、湿度控制不理想，即使将腹腔注射角叉菜胶的剂量增加到100 mg/kg，形成的尾静脉血栓长度也只有20～30 mm。尾静脉血栓形成是由角叉菜胶损伤血管内皮的作用和冷环境因素协同作用的结果。小鼠在冷环境下，采用角叉菜胶腹腔注射，使血管内皮细胞受损，从而诱发尾静脉血细胞聚集、血流淤滞，进而形成暗红色血栓。这种造模方法简便实用，血栓形成的病理生理与临床血栓形成的病理生理接近。血栓形成后可引起血管堵塞，导致组织器官缺血缺氧，诱发一系列的血管栓塞性疾病。

血栓形成和血液成分、凝血功能密切相关，活化部分凝血激酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)是反映凝血功能的比较重要的参考指标。APTT主要是反映内源性凝血系统的常用凝血指标，可以反映血液中内源性凝血因子含量及其活性变化；PT主要是反映外源性凝血系统的常用凝血指标[7]。本研究发现，角叉菜胶诱导小鼠尾部血栓形成后，血浆PT明显缩短，而腹腔注射重组水蛭素能明显延长血浆PT，对APTT无影响，提示重组水蛭素是通过外源性凝血系统改善血液的高凝状态。

前列环素(PGI2)和血栓恶烷A2(TXA2)是血浆中的两种不稳定的生物活性物质，6-keto-PGF1a和TXB2分别是其代谢生成的稳定产物，检测血浆中6-keto-PGF1a和TXB2含量能反映血浆中PGI2和TXA2的水平[8-9]。血小板粘附、聚集、释放功能与血栓形成密切相关。TXA2由血小板产生并释放入血，对血小板具有促进聚集作用，是血小板活化的标志物，对血管平滑肌有收缩作用。PGI2主要由血管内皮细胞产生，中性粒细胞也可以合成，具有舒张血管功能，具有对抗血小板TXA2的作用。PGI2和TXA2两者间保持着平衡，共同维持血液正常的凝血功能。实验结果表明，角叉菜胶诱导小鼠血栓形成后，PGI2和TXA2 的平衡关系被打破，促进血小板聚集，诱导血栓形成，而腹腔注射重组水蛭素能显著抑制TXA2的分泌，促进PGI2的分泌，起到了重建两者平衡的作用。

纤溶系统调节纤溶活性的重要指标包括t-PA和PAI-1，两者共同维持血液的流动性和血管的通畅状态。组织型纤溶酶原激活物(t-PA)作为一种纤溶酶原生理性激活剂，在血栓纤溶过程中起到关键性的启动作用。纤溶酶原主要由内皮细胞和肝脏产生，由t-PA激活转变成纤溶酶才具有溶解血栓的功能。PAI-1可以特异性结合t-PA，阻止t-PA激活纤溶酶原。两者动态平衡的破坏可导致血管内局部纤维蛋白分解速度降低，引起纤维蛋白沉积，导致血管内血栓形成[4]。本实验结果显示，角叉菜胶促进血管内膜损伤，导致局部血栓形成，t-PA激活纤溶酶原发挥纤维蛋白溶解作用。而血管内皮细胞损伤和血小板活化后可释放大量的PAI-1，其可与t-PA以1:1的比例结合使t-PA灭活，消耗大量的t-PA，降低纤溶活性，使血液处于高凝状态，容易导致血栓形成。腹腔注射重组水蛭素能改善血管内皮细胞损伤，抑制PAI-1的释放，同时促进t-PA释放，增强了纤溶功能，减少了血栓形成。

实验结果表明，腹腔注射重组水蛭素具有剂量依赖性的抗血栓作用，可以延长PT，增加tPA的释放，同时抑制PAI-1的释放，且具有内皮保护作用。重组水蛭素高剂量组与临床常用药阿司匹林没有显著性差异，说明重组水蛭素具有明确的临床应用价值。