熊果酸对糖尿病小鼠心肌病变的作用及其机制*

杨张良， 徐慧琳， 程 茵， 赵金帼， 周宇杰， 翁杨菁， 王旭焘， 齐敏友

(浙江工业大学药学院药理研究所， 杭州 310014)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是糖尿病严重的心血管并发症之一，也是糖尿病致死、致残的主要原因之一，炎症反应在糖尿病心肌病发病中起了关键作用[1-2]。NOD样受体蛋白3 (NOD-like receptor protein 3, NLRP3)炎症小体是一种调控机体炎症反应的复合蛋白，其激活可上调下游促炎细胞因子白介素-1β (interleukin-1β, IL-1β)的表达，与糖尿病及糖尿病并发症的进展关系密切[3]。Luo等[4]研究发现，NLRP3炎症小体在2型糖尿病大鼠心肌组织中表达显著升高，沉默NLRP3基因可以改善糖尿病大鼠心肌病。熊果酸(ursolic acid, UA)广泛存在于女贞、夏枯草等天然植物中，具有抗肿瘤、抗炎等药理活性[5-6]。本课题组前期实验报道，熊果酸通过降血糖、抗氧化和抑制心肌组织转化生长因子-β1 (transforming growth factor-β1, TGF-β1)生成，改善糖尿病小鼠心肌纤维化[7]。但熊果酸能否抑制心肌组织NLRP3炎症小体表达，进而对心脏起保护作用，鲜有报道。本实验通过建立高脂饮食联合链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)诱导的2型糖尿病小鼠模型，观察熊果酸改善心肌组织病变的作用及其机制，为临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与设备

链脲佐菌素(HPLC≥98%，美国Sigma公司)；熊果酸(HPLC≥98%，西安开来公司)；血糖仪、血糖试纸(Onetouchultraeasy，美国Johnson公司)；肌酸激酶、乳酸脱氢酶、超氧化物歧化酶、丙二醛试剂盒(南京建成研究所)；兔抗小鼠NLRP3抗体、兔抗小鼠IL-1β抗体(武汉博士德公司)。超低温冰箱(702，美国Thermo公司)；电子天平(AL104，瑞士Mettler Toledo公司)；超纯水仪(PureLab Classical，英国ELGA)；均质分散机(D-160，北京大龙公司)；大容量高速冷冻离心机 (Z36HK，德国Hermle公司)；恒温水浴箱(WB22LA，德国Memmert公司)；多功能酶标仪(Synergy H1，美国Bio Tek公司)；倒置荧光显微镜(TI-S，日本Nikon公司)。

1.2 实验动物和模型建立

健康雄性ICR小鼠30只，SPF级，(20±2) g，由浙江省实验动物中心提供。30只小鼠随机分为对照组(n=10)和造模组(n=20)。对照组和造模组分别以常规饮食及高脂饮食饲养，连续6周。将STZ溶于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液。造模组小鼠腹腔注射STZ(30 mg/kg)，对照组小鼠腹腔注射等体积柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，连续5 d，每日一次。9 d后测定空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)，超过11.1 mmol/L视为糖尿病模型。造模组20只糖尿病小鼠随机分为模型组和熊果酸组(n=10)。第7-16周，对照组给予普通饲料，模型组和熊果酸组给予高脂饲料，熊果酸研磨成粉，用生理盐水制成混悬液，超声混匀。熊果酸组小鼠灌胃熊果酸(100 mg/kg)，正常组和模型组小鼠灌胃等体积生理盐水，连续8周。

1.3 一般指标检测

小鼠末次给药后，禁食不禁水12 h，称体重并测定空腹血糖。

1.4 样本收集

血样本留取：小鼠摘眼球取血，常温静置6 h，离心取上清，-20℃冰箱保存待用。心脏质量指数(heart mass index, HMI)和左室质量指数(left ventricular mass index, LVMI)测定：处死小鼠，迅速摘取心脏，挤出心腔血液，剪除心耳、血管及心包膜，用生理盐水洗净后称取心重；剪除心房及右心室，称取左心室重；HMI =心重(mg)/体重(g)；LVMI =左心室重(mg)/心重(mg)。心肌组织样本留取：取适量心肌组织置于4%多聚甲醛溶液中固定，其余左心室心肌组织置-80℃超低温冰箱保存待用。

1.5 生化指标检测

按试剂盒说明书测定血清肌酸激酶(creatine kinase, CK)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)活性；心肌组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量。

1.6 病理学检测

心肌组织置于4%多聚甲醛溶液中固定72 h后，将左心室沿纵轴切成约2 mm的片，脱水，透明，石蜡包埋后保存。临用时，将蜡块切成4 μm厚片，65℃烤片1 h，二甲苯脱蜡，无水乙醇梯度水化，苏木素液染色和伊红染色，无水乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。400倍光镜下观察心肌细胞病理改变并拍照。

1.7 免疫组化检测NLRP3、IL-1β蛋白质表达

将蜡块切成4 μm厚片，切片加热，脱蜡至水；10 mmol/L柠檬酸盐缓冲液煮沸2 min，3% H2O2处理10 min进行抗原热修复。使用山羊血清封闭后，加入兔抗小鼠NLRP3、IL-1β多克隆抗体(1∶100)4℃过夜，PBS清洗；加入生物素标记的二抗，孵育20 min，PBS清洗；滴加Envision工作液，孵育20 min；滴加DAB显色，显微镜下观察显色程度后水洗；苏木素轻度复染，脱水，二甲苯透明，树胶封片。

于400倍光镜下，每组选取6个视野进行观察、拍摄；采用Image Pro Plus 6.0软件分析，计算每张图片的吸光度=积分吸光度/面积，并进行统计学分析。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 熊果酸对小鼠一般体征、体重和血糖的影响

对照组小鼠精神良好，毛色洁白，饮食、摄水正常，体重逐步增加。模型组小鼠精神萎靡，毛色深黄，多饮、多食、多尿；与对照组比较，体重显著降低、空腹血糖显著升高(P<0.01，表1)。熊果酸组小鼠精神较好，毛色较亮，三多一少症状较模型组明显改善；与模型组比较，熊果酸组小鼠体重有增加趋势，但无统计学差异(P>0.05)，血糖显著降低(P<0.01，表1)。提示熊果酸能有效降低糖尿病小鼠血糖水平。

Tab. 1 Changes of body weight and fasting blood glucose in mice before and after ursolic acid administration ±s, n=10)

BW: Body weight; FBG: Fasting blood glucose; UA: Ursolic acid

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsmodel

2.2 熊果酸对HWI、LVMI的影响

与对照组相比，模型组小鼠心脏质量指数和左室质量指数增大(P<0.01)；与模型组相比，熊果酸组小鼠心脏质量指数和左室质量指数减小(P<0.01,P<0.05，表2)。提示熊果酸能有效改善糖尿病小鼠心脏肥大和左室肥厚。

GroupHMI (mg/g)LVMI (mg/mg)Control3.15±0.240.58±0.05Model4.19±0.55**0.69±0.07**UA3.64±0.28##0.62±0.02#

HMI: Heart mass index; LVMI: Left ventricular mass index; UA: Ursolic acid

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

2.3 熊果酸对血清CK、LDH活性和心肌SOD活性、MDA含量的影响

与对照组相比，模型组小鼠血清CK、LDH水平显著升高(P<0.01)；与模型组相比，熊果酸组小鼠血清CK、LDH水平显著降低(P<0.01，表3)。提示熊果酸具有减轻糖尿病小鼠心肌组织损伤的作用。

与对照组相比，模型组小鼠心肌组织SOD活力明显降低(P<0.05)，MDA含量显著升高(P<0.01)；与模型组相比，熊果酸组小鼠SOD活力明显升高(P<0.05)，MDA含量明显降低(P<0.05，表3)。提示熊果酸能明显提高糖尿病小鼠心肌组织的抗氧化能力。

GroupCK (U/ml)LDH (U/L)SOD (U/mg prot)MDA (nmol/mg prot)Control0.44±0.1112122±1977110.1±18.52.9±0.8Model2.19±0.35**19474±3649**84.5±10.9*5.7±1.4**UA1.04±0.22##14648±1626#122.9±14.1##3.8±0.7#

CK: Creatine kinase; LDH: Lactate dehydrogenase; SOD: Superoxide dismutase; MDA: Malondialdehyde; UA: Ursolic acid

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

2.4 熊果酸对心肌组织形态学的影响

HE染色显示：对照组小鼠心肌纤维排列整齐，横纹清晰，细胞结构完整，细胞核分布于细胞中央且大小均一，细胞间隙正常，间质未见炎细胞浸润。模型组小鼠心肌纤维排列紊乱，细胞水肿、肥大，可见局灶性坏死、细胞间质大量炎细胞浸润。熊果酸组小鼠心肌纤维排列较整齐，细胞肥大明显好转，间质炎细胞仅少量存在(图1，箭头表示炎性细胞)。

2.5 熊果酸对心肌组织NLRP3、IL-1β表达的影响

如图2、3(箭头表示NLRP3、IL-1β蛋白)和表4所示，在免疫组化实验中，NLRP3、IL-1β主要表达于心肌细胞浆中。对照组小鼠仅有少量NLRP3、IL-1β表达；与对照组相比，模型组小鼠NLRP3、IL-1β表达量显著升高(P<0.01)；与模型组相比，熊果酸组小鼠NLRP3、IL-1β表达量显著降低(P<0.01)。

Fig.1Effects of ursolic acid on pathological changes in myocardium of diabetic mice (HE ×200)

A: Control group; B: Model group; C: UA group; UA: Ursolic acid

GroupNLRP3IL-1βControl0.0732±0.01760.0653±0.0284Model0.2125±0.0137**0.1978±0.0247**UA0.1439±0.0129##0.1019±0.0170##

NLRP3: NOD-like receptor protein 3; IL-1β: Interleukin-1β; UA: Ursolic acid

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsmodel

Fig.2Expression of NLRP3 in the myocardium tissue of mice (×400)

A: Control group; B: Model group; C: UA group; UA: Ursolic acid

Fig.3Expression of IL-1β in the myocardium tissue of mice (×400)

A: Control group; B: Model group; C: UA group; UA: Ursolic acid

3 讨论

DCM是一种独立于高血压、动脉粥样硬化及其他心脏病变的特异性心肌病，低度慢性炎症反应与DCM关系密切[8]。本实验通过高脂饮食结合小剂量STZ制备糖尿病小鼠模型。模型小鼠空腹血糖中等程度升高，表现出多饮、多食、多尿和体重减轻症状，心脏质量指数、左室质量指数增大，血清CK、LDH活性显著升高，说明造模成功。HE染色显示：心肌纤维排列紊乱、细胞肥大、间质大量炎细胞浸润，符合DCM病理特征。给予熊果酸治疗8周后，上述各项指标明显好转，心肌组织NLRP3炎症小体和IL-1β表达显著下调，说明熊果酸能减轻心肌炎症反应，从而对心肌组织起到保护作用。

NLRP3炎症小体是由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)、前体天冬半胱氨酸酶-1(pro-caspase-1)组成的蛋白复合体，是固有免疫的重要组成部分[3]。研究报道，高糖环境下，受损的线粒体释放大量活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)，机体发生氧化应激反应；过度增加的ROS可以激活NLRP3炎症小体，引发一系列级联反应，进而导致下游促炎细胞因子IL-1β剪切成熟和分泌，引起组织炎症反应[3]。因此，抑制NLRP3炎症小体激活是减轻炎症反应的关键。

熊果酸是一种五环三萜类化合物，其抗炎作用被多次报道。Lu等[9]研究发现，熊果酸可减轻D-半乳糖诱导的小鼠大脑炎症反应；Leng等[10]实验表明，熊果酸通过促进巨噬细胞自噬，抑制IL-1β分泌，减轻炎症反应，改善小鼠动脉粥样硬化。本实验结果显示，糖尿病小鼠经熊果酸干预后，心肌组织NLRP3和IL-1β蛋白质表达显著减少，表明熊果酸对心肌组织具有抗炎作用。此外，相较于模型组，熊果酸组小鼠空腹血糖显著降低，心肌组织MDA含量下降33.3%，SOD活力上升45.4%，表明熊果酸能减轻心肌组织氧化应激水平，增加心肌抗氧化能力，这与我们前期报道的结果相一致[7]。

综上所述，熊果酸改善糖尿病心肌病变，其作用机制可能与控制血糖，减轻心肌组织氧化应激损伤、下调NLRP3炎症小体和IL-1β的表达有关。鉴于临床对DCM尚缺乏有效的治疗手段和治疗方法，阐明熊果酸对DCM的作用机制，具有重要的理论意义和实用价值。