运动对老年肥胖大鼠脂联素的影响*

苏 敏， 柏友萍△， 宋威巍， 王 明， 沈瑞睿， 杜康健， 夏行权， 聂刘旺

(1. 安徽师范大学体育学院， 2. 安徽省生物资源保护和利用重点实验室， 安徽师范大学， 芜湖 241003)

我国人口基数大，随着国人预期寿命的不断增加，老年人口增长迅速。老年人随着年龄的增长，新陈代谢能力逐渐降低，使得在相同能量摄入条件下老年肥胖的患病率逐年上升，导致肥胖相关疾病的发病率日益增加，严重危害老年人的健康。因此，老年肥胖是我国一个严重的问题。探讨老年肥胖发病机制，预防和减轻老年肥胖，提高老年人群的生活质量成为目前的一个研究热点。脂肪细胞因子是由脂肪组织分泌的，直接或间接参与肥胖和肥胖相关疾病的发生与发展[1]。脂联素(adiponectin)是脂肪细胞特异分泌的蛋白质类激素，是目前发现的对人体有保护作用的脂肪细胞因子。脂联素不仅具有降低胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)、抗炎和抗动脉粥样硬化等生物学作用，还与肥胖相关疾病有着密切的关系。

以往的研究已经证实，运动是减肥的主要手段，但在减肥过程中运动对肥胖相关疾病，尤其是对肥胖导致的胰岛素抵抗的干预机制目前尚不清楚。本实验通过制定运动方案，探讨运动对肥胖老年大鼠内脏脂肪组织脂联素基因mRNA表达和蛋白质表达、血浆脂联素浓度、胰岛素抵抗及血糖的影响，为制定运动减肥、科学健身措施，以及预防老年人肥胖相关疾病的生理机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

脂联素mRNA：引物合成(上海生工技术有限公司)，M-MLV反转录酶(M1705), GoTaq®qPCR Master Mix (A6002) 为Promega产品；Trizol (SN114)，Oligo dT15，Random prime，RNase Inhibitor (R0004)，100 bp DNA Ladder(SN124)，脂联素蛋白质表达测定用电泳缓冲液(25 mmol/L Tris，0.25 mol/L 甘氨酸，0.1% SDS)(SN343)，显影液、定影液(SN340)，羊抗兔IgG-HRP(H+L) (SN134)，羊抗小鼠IgG-HRP(H+L) (SN135) 为Sunshinebio产品；PVDF膜(Millipore)；Supersignal West Pico Trial kit(Pierce/34079)；兔抗大鼠脂联素抗体(Bioss/bs-0471R)；小鼠抗β-actin抗体(Boster/ BM0627)，PageRuler Prestained Protein Ladder (Fermentas/SM0671)。脂联素浓度和胰岛素浓度测定用ELISA试剂盒 (美国TSZ公司，上海研域生科公司代理)；血糖试剂盒(北京利德曼生化股份有限公司)。电子秤(JM-A20001/中国)，台式高速离心机(eppendorf/Centrifuge 5417)，高速冷冻离心机(力康生物医疗科技/Neofuge15R)，PCR仪(MJ research/PTC200)，荧光定量PCR检测系统(博日/line-gene K FQD-48A)，凝胶成像系统(江苏捷达科技/JD801)，可见紫外分光光度计(日立/U-2001)，洗板机(Tecan Columbus Washer/瑞士)，酶标仪(Tecan Sunrise/瑞士)，6跑道大鼠跑台(Wi32812/北京)。

1.2 实验动物

实验动物为老年肥胖大鼠。选取雄性SD大鼠(n=50)，清洁级，鼠龄21 d。大鼠先适应性喂养1 d，测量其体重为(74.5±7.4) g，体长为(12.4±0.5) cm。根据体重无差异(P>0.05)原则，随机分为对照组(n=12)、实验组(n=32)与老年运动组(n=6)，构建老年肥胖大鼠模型。对照组和老年运动组大鼠喂饲普通饲料(6.0%脂肪率)；实验组根据青春期、壮年期和老年期分三个阶段喂饲高脂饲料，第一阶段(第4～10周)喂饲36.3%脂肪率饲料，第二阶段(第31～32周)和第三阶段(第56～60周)喂饲40.0%脂肪率饲料。老年肥胖大鼠建模成功的依据为：鼠龄60周，体重≥对照组体重120%[2]。60周后，非肥胖大鼠(对照组和老年运动组)体重为(758.7±45.6) g，根据肥胖标准，肥胖大鼠建模成功的体重≥910.5 g。实验期间，大鼠分笼饲养，自由饮水，饲养房的相对湿度为50%～70%，温度20℃±2℃，每天光照12 h，每周测量一次体重。本次实验用SD大鼠、大鼠饲料和垫料均购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，该项研究获得安徽师范大学动物伦理学会的同意(20130225)，本实验中对动物的处死采用麻醉方法，符合中华人民共和国颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》[3]。

1.3 实验分组

考虑到本实验中对照组与老年运动组饲养方式相同，将其合并随机选取12只大鼠，再随机分为对照组(control group，C)和老年运动组(aged exercise group，AE)，n=6，体重分别为(766.4±39.3) g和(768.0±17.7) g。选择老年肥胖大鼠12只，随机分为2组(n=6)，肥胖对照组(obese control group，OC)和肥胖运动组(obese exercise group，OE)，体重分别为(952.6±69.7) g和(940.5±68.4) g，组间体重无统计学差异(P>0.05)。运动干预期间，各组大鼠每天每只定量供给30 g喂普通饲料。实验期间，大鼠死亡2只(C组与OC组各1只)。

1.4 运动方案

运动组大鼠第61周开始进行为期5 d，每天2～3次的适应性跑台练习。该运动方案设计以本实验室前期研究中的大鼠运动方案为依据[4]。该运动处方方案为大鼠跑台坡度为0°。运动处方：15 m/min×15 min为1组，共运动4组，组间休息5 min，1次/天，5次/周，每周二和周五休息，共持续8周。对照组不运动，安静状态下笼养。

1.5 采样与测试

经8周运动方案干预后，大鼠停止运动2 d。随后禁食12 h，禁水6 h，腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉大鼠，剖腹取大鼠腹主动脉血液，立即抗凝分离血浆，部分血浆用于测定空腹血糖，部分血浆保存于-80 ℃冰箱待测定胰岛素和脂联素浓度。计算胰岛素抵抗[IR=(G0×I0)/22.5，I0为空腹血浆胰岛素含量(mU/L)，G0为空腹血糖浓度(mmol/L)[5]]。采集大鼠内脏脂肪组织，取部分含血管少的脂肪立即置于Trizol中，待脂联素mRNA表达测定；部分内脏脂肪组织用铝箔纸包裹，待脂联素蛋白质表达测定。样本均保存于-80℃冰箱。

1.5.1 qRT- PCR测定各组大鼠内脏脂肪组织脂联素mRNA表达 脂联素引物：上游GGGACAACAATGGACTCTATG，下游CTGTCGCCTGTTCTTT-GATTC；β-actin上游CTAGAGGGTGTCCGCAATG，下游CAGTGGGAAGGTGTAGTC-AGTC。

内脏脂肪组织中总RNA：匀浆→相分离→RNA沉淀→RNA洗涤→RNA溶解。RT反应以脂联素mRNA为模板，逆转录合成cDNA，SYBR Green Realtime-PCR，PCR扩增：95℃ 2 min预变性，1个循环；95℃ 10 s变性，60℃ 1 min退火及延伸，40个循环。溶解曲线分析：温度控制在60 ℃～95 ℃，温度间隔0.3 ℃，时间5 s/次，脂联素Tm值为79.5 ℃。阈值与Ct值由软件自动得出，ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(β-actin)，采用2-ΔCt法计算相对定量。

1.5.2 Western blot测定各组内脏脂肪组织脂联素蛋白表达 取20 μl稀释好的上样样品至0.5 ml离心管中，加入4 μl 6×SDS上样缓冲液。配制5%的聚丙烯酰胺浓缩胶电泳，进行转膜。将切好的膜置于甲醇中活化15 s后，移至转移缓冲液中浸泡，然后将凝胶上的脂联素蛋白质移至PVDF膜上，以250 mA电流转移1.5 h。将含有脂联素的膜用TBS移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1 h。加封闭液将内参一抗(1∶1 000稀释)，兔抗(1∶500稀释)、4℃孵育过夜，用TBST室温下脱色摇床上清洗4次。同上方法准备二抗稀释液(1∶2 000)并与膜接触，室温下孵育1 h后，室温下脱色摇床上用TBST清洗5次。将化学发光试剂与膜中的蛋白质混合孵育，最后将胶片进行扫描，用凝胶图象处理系统和Image J2软件分析目的条带的净吸光度值。

1.5.3 ELISA测定各组血浆脂联素浓度 采用ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)的双抗体夹心法测定样本中脂联素及胰岛素浓度。在Excel表格中，横坐标为标准品浓度，纵坐标为对应的吸光度 (absorbance，A)值，绘制标准品线性回归曲线。脂联素标准品试剂测量值与实际测量值相关系数r=0.997，曲线方程为y=0.009x-0.018；胰岛素标准品试剂测量值与实际测量值相关系数r=0.999，曲线方程为y=0.020x+0.008，把该方程代入Excel表中，得到相应的浓度值，再乘以5则为样本实际浓度。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 运动后老年肥胖大鼠脂肪组织脂联素mRNA和蛋白质表达及血浆脂联素浓度的比较

脂联素mRNA表达水平的比较：OC组显著低于C组(P<0.01)，AE组显著高于C组(P<0.01)；OE组显著高于OC组(P<0.01)；OE组与AE组之间差异无显著性(P>0.05，表1)。

脂联素蛋白质表达水平的比较：OC组显著低于C组(P<0.01)，AE组显著高于C组(P<0.01)；OE组显著高于OC组(P<0.01)和AE组(P<0.01，图1，表1)。

血浆脂联素浓度比较：OC组、AE组与C组相比差异均无显著性(P>0.05)；OE组显著高于OC组与AE组(P<0.01，P<0.05，表1)。

GroupnAdiponectin mRNAAdiponectin proteinPlasma adiponectinconcentration(μg/L)C56.961±1.7481.284±0.01770.222±5.522OC54.243±0.575**1.069±0.072**64.444±3.239AE69.913±1.170**1.503±0.083**72.685±2.798OE610.644±2.090##1.729±0.058##△△79.722±4.169##△

C： Control group； OC： Obese control group； AE： Aged exercise group； OE： Obese exercise group

**P<0.01vsC group；##P<0.01vsOC group；△P<0.05,△△P<0.01vsAE group

Fig.1Comparison of adiponectin protein expression among the four groups after the experiment

2.2 运动后老年肥胖大鼠血糖和胰岛素抵抗的比较

血糖浓度比较：OC组显著高于C组(P<0.01)，AE组与C组之间差异无显著性(P>0.05)；OE组显著低于OC组(P<0.05)；OE组与AE组之间差异无显著性(P>0.05，表2)。

胰岛素抵抗比较：OC组显著高于C组(P<0.01)，AE组与C组之间差异无显著性(P>0.05)；OE组显著低于OC组(P<0.01)；OE组与AE组之间差异无显著性(P>0.05，表2)。

GroupnBlood glucose(mmol/L)Insulin resistanceC511.636±3.56815.880±4.272OC517.930±6.094**24.158±8.001**AE610.635±1.72116.964±4.858OE612.842±1.905#15.403±3.454##

C： Control group； OC： Obese control group； AE： Aged exercise group； OE： Obese exercise group

**P<0.01vsC group；#P<0.05,##P<0.01vsOC group

3 讨论

脂联素是一种由脂肪细胞分泌的蛋白质类激素，在调节胰岛素敏感性、葡萄糖和脂质代谢方面起着重要作用，同时还具有抗炎和抗动脉粥样硬化等特性[6]。有研究显示[7]，BMI与血浆脂联素浓度密切相关，13名肥胖但无疾病者与9名肥胖糖尿病患者在进食低能量饮食2个月后，随着体质量的下降，无论糖尿病患者还是非糖尿病患者，血浆脂联素水平均显著升高。另有研究表明，大网膜脂肪组织中脂联素mRNA的表达量随着BMI的升高而下降，肥胖症患者大网膜脂肪组织脂联素mRNA表达水平显著降低，这或许与肥胖者易患高血压、糖尿病等疾病有关[8-9]。本实验结果显示，老年肥胖大鼠内脏脂肪组织脂联素mRNA表达和蛋白质表达均明显低于正常老年大鼠。

近年来，有关运动干预对脂联素影响的研究越来越多。本实验室前期研究发现，不同运动强度干预均能升高青春期肥胖大鼠内脏脂肪组织脂联素mRNA表达量，运动强度与表达量呈正相关[10]。陈斌等[11]实验证实，6周的运动干预能显著增强胰岛素抵抗大鼠脂肪组织脂联素mRNA表达，改善胰岛素抵抗，说明运动或许通过增加脂联素的表达来改善胰岛素抵抗。吴卫东等[12]研究显示，14周有氧运动能显著提高ApoE基因缺陷小鼠在动脉粥样硬化形成过程中脂肪组织脂联素mRNA的表达，抑制动脉粥样硬化斑块的发展。说明有氧运动对脂联素mRNA的作用或许是运动防治动脉粥样硬化的潜在机制。Kondo等[13]对肥胖女性进行有氧训练发现，训练前受试者脂联素水平显著下降，而7个月的有氧训练能显著提高其脂联素水平。Ryan等[14]对40名久坐不动的超重和肥胖女性进行有氧与抗阻运动训练，结果显示6个月的训练显著降低了体重、BMI、腰围与臀围，但血浆脂联素水平却无明显变化。本实验采用运动处方为15 m/min×15 min为1组，共运动4组，组间休息5 min，1次/天，5次/周，持续干预8周后发现，运动能明显提高老年大鼠和老年肥胖大鼠内脏脂肪组织脂联素mRNA表达和蛋白质表达，同时增加血浆脂联素浓度。

有研究显示，肥胖与胰岛素抵抗密切相关，肥胖尤其腹部肥胖是引起胰岛素抵抗的重要危险因素之一[15]。Lim等[16]研究显示，每天60 min、每周3次、持续10周的有氧训练能有效升高中青年女性血浆脂联素水平，同时伴随着胰岛素抵抗的降低。超重与肥胖增加胰岛素抵抗，大大提高糖尿病发生的风险，不同运动强度结合白藜芦醇给药可增加肥胖大鼠胰岛素敏感性，降低空腹血糖[17]。姜继权等[18]采用Meta分析发现，不同运动干预方式均可对糖尿病前期人群餐后2 h血糖和胰岛素抵抗指数产生明显影响，但对空腹血糖作用不显著。罗曦娟等[19]研究证实，有氧或抗阻运动均可使糖尿病前期人群空腹血糖显著下降，并在一定程度上使血糖下降至正常水平。刘敏[20]等研究发现，4周有氧运动训练能明显改善肥胖青少年脂肪过度堆积状况及胰岛素抵抗，对肥胖青少年心血管疾病的发生和发展具有一定的预防和延缓作用，同时还具有良好的抗炎效应。许冬明等[21]实验研究认为，血糖的下降可能是通过影响大鼠体内脂联素和瘦素的水平，调节脂肪代谢和胰岛素分泌完成的。本实验研究显示，老年肥胖大鼠的胰岛素抵抗和血糖浓度较自然生长老年大鼠明显升高，而8周运动干预能有效改善胰岛素抵抗，降低肥胖老年大鼠的血糖浓度，推测运动可能是通过升高脂联素浓度来降低血糖，从而有利于防治糖尿病的发生与发展。

总之，本研究表明，老年肥胖伴随高血糖和胰岛素抵抗、内脏脂肪组织脂联素mRNA和蛋白质表达降低；对老年肥胖大鼠的运动干预能显著增加内脏脂肪组织脂联素mRNA表达和蛋白质表达，升高血浆脂联素水平，改善胰岛素抵抗，降低血糖。