当归对实验性血虚便秘模型小鼠结肠组织形态和黏液分泌的影响*

杜丽东， 任 远△， 吴国泰， 牛亭惠， 王志旺， 邵 晶

(1. 甘肃中医药大学， 兰州 730000； 2. 甘肃省中药药理与毒理学重点实验室， 兰州 730000)

血虚便秘是中医临床的一种常见证型，多见于老年，妇女产后、崩漏失血，或痔疮、手术等大失血，以及忧思焦虑、用脑过度者。由于血虚津少或津液暗耗，不能下润大肠，肠道干燥，故大便干结难下，症见大便干结，头晕目眩，心悸失眠，面色日光白无华，唇甲色淡，舌质淡，脉细无力。中医对其的治则是滋阴养血，润肠通便[1]。

当归是伞形科植物当归Angelicaesinensis (Oliv.) Diels的干燥根，为甘肃道地药材之一。具有补血活血、调经止痛、润肠通便的功效，主治血虚萎黄，眩晕心悸，月经不调，经闭痛经，虚寒腹痛，肠燥便秘，风湿痹痛，跌打损伤，痈疽疮疡等。古典医籍《沈氏尊生书》记载的“润肠丸”和《脾胃论》记载的“导滞通幽汤”均以当归配伍治疗血虚便秘；当代名中医亦喜用当归配伍治疗血虚便秘，如李国栋自拟“养血润肠方”[2]，张东岳之“秘宝康”[3]等。用当归的补血润肠功效，治疗血虚便秘取得了良好的疗效。

本研究采用灌胃复方地芬诺酯联合皮下注射乙酰苯肼并腹腔注射环磷酰胺复制小鼠血虚便秘模型，灌胃当归水煎液进行干预，通过观察小鼠一般状态，检测首粒黑便排出时间(FBDT)、粪便和结肠含水量，取结肠组织进行HE和AB-PAS染色，观察小鼠结肠组织形态变化和黏液分泌情况，初步探讨当归防治血虚便秘的作用及机制，为扩大当归防治血虚便秘的临床应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

当归饮片，批号：160502，兰州复兴厚药材有限公司生产，经甘肃中医药大学药学院刘峰林副教授鉴定，为伞形科植物当归Angelicaesinensis(Oliv.) Diels根的切片。当归水煎液的制备方法为：取当归饮片，加8倍量水浸泡1 h，煎煮1 h，滤过，药渣加6倍量水煎煮1 h，合并两次滤液，过滤，浓缩至1.7 g生药/ml，置冰箱冷藏，用时平衡至室温。复方地芬诺酯片(compound diphenoxylatetablet，DPN)，批号：1605030，常州康普药业有限公司生产；乙酰苯肼(N-acetylphenylhydrazine，APH)，批号：20150701258，上海源叶生物科技有限公司生产；环磷酰胺(cyclophosphamide，CPA)，批号：04150405，山西普德药业股份有限公司生产；常通舒颗粒，批号：160101，贵州威门药业股份有限公司生产。活性炭，批号：20150903，烟台市双双化工有限公司生产；阿拉伯树胶粉，批号：20150128，上海中秦化学试剂有限公司生产；过碘酸-雪夫染色(Alcian blue-periodic acid Schiff staining, AB-PAS)试剂盒，批号：20150928，北京索莱宝科技有限公司生产。

1.2 主要仪器

BX51-32H01型显微镜(日本Olympus)。BS110型电子天平(德国 Sartorius)。TEC5型组织包埋机，VIP5全自动密闭式组织脱水机(日本Sakura Finetek公司)。RM2135石蜡切片机(德国Leica公司)。电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)。

1.3 实验动物

SPF级KM小鼠60只，雌雄各半，体质量(18±2) g，由甘肃中医药大学实验动物中心提供，合格证号SCXK (甘) 2015-0002。小鼠自由摄食、饮水，喂食标准饲料(由甘肃中医药大学实验动物中心提供)，饲养温度(20～24) ℃，相对湿度50%～60%。

1.4 分组、造模及给药

小鼠适应性饲养3 d后，按性别、体重随机分为6组：正常对照组(Control)、血虚便秘模型组(Model)、阳性对照组(Positive)、当归高剂量组(HDD)、当归中剂量组(MDD)、当归低剂量组(LDD)，n=10。参考文献并在预实验的基础上[4-5]，除正常组外，其余各组小鼠灌胃DPN混悬液25 mg/kg，1次/d，5 d为一个给药周期，共4个周期，每两个周期间停药2 d；并在实验的第1、4、7、10天皮下注射APH 60mg/kg，实验第10～14天腹腔注射CPA 40mg/kg，复制小鼠血虚便秘模型。从实验第14天起，当归高、中、低剂量组小鼠分别灌胃当归水煎液16.67、8.33、4.17g生药/kg (分别相当于临床上60kg体重成人日用药量的20、10和5倍)；阳性对照组小鼠灌胃常通舒颗粒溶液5 g/kg(相当于临床上60 kg体重成人日用药量的5倍)；正常对照组和血虚便秘组小鼠灌胃等体积生理盐水。造模药物DPN混悬液每天上午9:00给药，治疗药物当归水煎液、通舒颗粒溶液及生理盐水每天下午16:00给药；给药容积10 ml/kg，连续28 d。

1.5 检测指标及方法

1.5.1 一般状态 实验期间观察各组小鼠活动状态，毛色，口、鼻、唇、尾颜色，粪便性状和数量。

1.5.2 首粒黑便排出时间、粪便含水量和结肠含水量 实验第27天，各组小鼠 (已禁食不禁水12 h) 灌胃5%活性炭末糊0.5 ml/只，单笼饲养并记录每只小鼠首粒黑便排出时间。实验第28天，取血后处死小鼠，取结肠残留粪便，称湿重，80℃恒温干燥10 h，称干重，按下式计算粪便含水量，粪便含水量=(湿重-干重)/湿重×100%；在距盲肠2 cm处取结肠长约2 cm，称湿重，60℃恒温干燥6 h，称干重，按下式计算结肠含水量，结肠含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.5.3 结肠组织形态学观察 实验第28天，各组小鼠在距直肠2 cm处取结肠长约1 cm，纵行剖开，用冷生理盐水冲洗干净，纵向取结肠肌条，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色，100倍光镜下观察结肠组织形态学变化。

1.5.4 结肠黏液分泌 实验第28天，各组小鼠在距直肠3 cm处取结肠长约1 cm，使用carnoy固定液(无水乙醇：冰醋酸：氯仿=6:1:3，V/V/V)固定，石蜡包埋切片，AB-PAS染色，200倍光镜下观察结肠黏液分泌[6]。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 对小鼠一般状态的影响

正常对照组小鼠反应灵敏，被毛密而有光泽，粪便形状规则，质稍软，互不粘连。与正常对照组比较，血虚便秘组小鼠蜷缩，萎靡，被毛枯疏、易掉、光泽暗淡，耳、鼻、唇、尾肤色苍白，排便数量减少，粪便干结、粘连。与血虚便秘组小鼠比较，阳性对照组、当归高、中、低剂量组小鼠上述血虚和便秘症状，有不同程度改善。

2.2 对小鼠排便、粪便和结肠含水量的影响

与正常对照组比较，模型组小鼠首粒黑便排出时间(first black defecation time, FBDT)明显延后，粪便含水量(water content in stool, WCIS)和结肠含水量(water content in colon,WCIC)均明显降低(P<0.01)。与血虚便秘组小鼠比较，阳性对照组、高、中、低3个剂量当归组小鼠FBDT明显延后(P<0.01，P<0.05，表1)，WCIC明显增加(P<0.01，P<0.05)，阳性对照组、当归高、中剂量组小鼠WCIS明显增加(P<0.05，表1)。

2.3 对小鼠结肠组织形态学变化的影响

正常小鼠结肠黏膜层(包括上皮层、固有层、黏膜肌层)、黏膜下层、肌层和浆膜层均未见明显病理改变，结肠黏膜层较厚，黏膜上皮完整，排列整齐，黏膜固有层大肠腺饱满。模型组小鼠结肠黏膜层萎缩变薄，黏膜固有层大肠腺明显萎缩，黏膜下层、肌层和浆膜层未见异常病理改变(图1)。

GroupFBDT(min)WCIS(%)WCIC(%)Control140.5±24.670.7±3.376.4±6.1Model199.8±33.0**47.9±11.9**58.8±7.4**Positive160.9±25.0##58.4±7.9#68.8±8.0#HDD154.6±34.7##60.9±8.9#70.9±8.7##MDD157.0±38.5#57.4±9.0#68.9±10.1#LDD162.1±36.2#56.7±9.869.1±9.4#

FBDT： First black defecation time； WCIS： Water contentinstool； WCIC： Water contentincolon； HDD： High-doseDanggui group； MDD： Middle-dose Danggui group； LDD： Low-doseDanggui group

*P<0.05,**P<0.01vsnormal control group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

Fig.1The comparison of histomorphology of colon in mice between the 6 groups(HE staining ×10)

A: Normal control group; B: Model group; C: Positivecontrolgroup; D: High-doseDangguigroup; E: Middle-doseDanggui group; F: Low-doseDanggui group

与正常对照组比较，模型组小鼠结肠黏膜层厚度明显减少(P<0.01)；与模型组比较，当归高、中、低剂量组小鼠结肠黏膜层厚度均明显增加(P<0.05，表2)。当归高、中、低剂量组结肠黏膜层厚度之间无统计学差异。

GroupDose(crude drug g/kg)MT (μm)Control —537.8±89.0Model —437.2±95.4**Positive 5507.7±84.7#HDD16.67509.4±82.8#MDD8.33503.3±89.4#LDD4.17503.1±87.5#

MT: Mucosa thickness； HDD: High-doseDanggui group； MDD: Middle-dose Danggui group； LDD: Low-doseDanggui group

*P<0.05,**P<0.01vsnormal control group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

2.4 对小鼠结肠黏液分泌的影响

正常小鼠结肠黏膜层上皮细胞和杯状细胞形态饱满、圆润，黏液分泌丰富，黏膜表面覆盖混合性黏液；模型组小鼠黏膜层上皮细胞和杯状细胞出现不同程度萎缩，黏膜表面黏液覆盖减少。当归高、中、低剂量组小鼠黏膜层上皮细胞和杯状细胞的萎缩有不同程度的恢复，黏液分泌增多(图2)。

Fig.2The comparison of colon mucus secretion in mice among the 6 groups(AB-PAS staining ×20)

A: Normal control group; B: Model group; C: Positivecontrolgroup; D: High-doseDangguigroup; E: Middle-doseDanggui group; F: Low-doseDanggui group

3 讨论

中医理论认为，血虚是因失血过多、脾胃虚弱、血液生化之源不足或者瘀血阻滞导致的血液不足，和(或)血的濡养功能减退引起的一种病理状态[7]。因血液亏损，脏腑百脉失养，最终导致全身虚弱，患者常表现为面色苍白，唇、舌、指甲色淡无华，头晕，心悸失眠，手脚发麻或脉细弱等。现代医学认为，贫血的形成原因包括红细胞生成减少(骨髓造血功能障碍、造血物质缺乏或利用障碍)，红细胞丢失或破坏过多(失血、溶血)等[2]。在中医实验研究中，常借鉴贫血的研究方法来研究和认识血虚证。现代研究建立的血虚模型包括失血性血虚模型、乙酰苯肼(APH)溶血性血虚模型、环磷酰胺(CPA)化学损伤性血虚模型和60Co-γ辐射损伤血虚模型[8-11]。本研究利用APH缓慢氧化破坏红细胞膜，使红细胞崩解、溶血、数量减少；利用CPA引起骨髓抑制，使造血细胞生成减少、白细胞和粒细胞数量减少，从双重环节造成实验小鼠出现血虚症。利用复方地芬诺酯 (DPN) 作用于肠壁阿片受体，降低肠道敏感性，提高平滑肌张力，提高回盲瓣和肛门括约肌张力，使肠蠕动减弱，肠内容物滞留时间延长、水分重吸收增多，产生收敛止泻作用。采用该复合方法建立的血虚便秘模型小鼠出现蜷缩萎靡、体毛枯疏、光泽暗淡，耳、鼻、唇、尾肤色苍白，粪便干结、排便时间延长、结肠和粪便含水量降低等表现，基本能体现中医血虚便秘证候[4-5,12-15]。

高、中、低三个剂量(16.67、8.33和4.17 g/kg·d) 的当归水煎液均能使首粒黑便排出时间提前，增加结肠含水量；16.67、8.33 g/kg·d的当归水煎液可使血虚便秘模型小鼠粪便含水量升高，以上结果为从结肠粪便水分吸收角度阐释当归“润肠通便”传统功效的药理机制提供了实验数据。常通舒颗粒由何首乌、当归、赤芍、火麻仁、桑椹五味药材组成，具有滋阴养血，润肠通便功效，用于习惯性便秘、老年性便秘及产后便秘，在研究中常用作血虚肠燥便秘的阳性对照药物[3]。

结肠肠壁由内向外依次为黏膜层 (包括上皮层、固有层、黏膜肌层)、黏膜下层、肌层和浆膜层。黏膜层的杯状细胞能合成、贮存黏液并将其分泌至肠腔，起润滑和保护肠壁的作用。研究显示，便秘时结肠黏膜腺体萎缩，腺泡减少且分布稀疏[16]。杯状细胞分泌的黏液中所含的以氨基乙糖和游离的乙糖基为代表的中性黏多糖，在过碘酸-雪夫染色(periodic acid Schiff staining, PAS)时呈红色；以分子末端含有唾液酸和硫酸酯类为代表的酸性黏多糖，在阿利新蓝染色 (Alcian blue staining, AB) 时呈蓝绿色；混合性黏液呈紫色[6]。本研究显示，灌胃16.67、8.33和4.17 g/kg·d三个剂量的当归水煎液干预后，模型组小鼠结肠黏膜和大肠腺体的萎缩出现不同程度的改善，黏膜层厚度明显增加，黏液分泌增加，以上结果为从结肠黏液分泌角度阐释当归“润肠通便”传统功效的药理机制提供了实验数据。

综上所述，当归可改善血虚便秘模型小鼠的血虚便秘证候、增加结肠和粪便含水量、软化粪便、促进粪便的排出，改善小鼠结肠黏膜和大肠腺体的萎缩，增加粘膜层厚度并增加黏液分泌，发挥其“润肠通便”的功效。