杭州市中心城区大气PM2.5暴露致大鼠肺部损伤作用研究*

田程远， 严 明△， 张 云， 刘珂舟， 郭 淼， 孙永红， 薛凌云， 祝 磊△， 徐 莹

(1. 杭州电子科技大学生命信息与仪器工程学院， 浙江 杭州 310018； 2. 绍兴文理学院医学院基础医学部， 浙江 绍兴 312000； 3. 浙江大学生物医学工程与仪器科学学院浙江省心脑血管检测技术与药效评价重点实验室， 杭州 310027)

近年来，随着我国经济粗放式地发展，化石能源消费增多等原因导致我国大气环境污染日趋严重，尤其雾霾污染呈迅速上升趋势，且爆发范围广、持续时间长，对民众健康造成了极大威胁[1]。大气颗粒物 (ambient particulate matter，PM) 是雾霾的主要成分之一。其中，PM2.5是空气动力学直径小于2.5μm的大气细颗粒物，由于其粒径小、比表面积大，且表面吸附了重金属、微生物等大量有毒、有害物质，可通过呼吸达到人体呼吸道深部、沉积于肺泡，甚至能穿过气血屏障进入血液循环系统，引发机体多个系统的广泛性损伤。流行病学资料显示，PM2.5暴露可诱发或加重肺部炎症、哮喘及动脉粥样硬化等疾病，且暴露量与疾病的发病率和死亡率密切相关[2,3]。

肺是呼吸系统的主要器官，对PM2.5的致伤作用十分敏感。毒理学研究表明：PM2.5暴露能导致小鼠肺阻力上升等肺功能改变，还能诱发肺泡塌陷和炎症反应等肺部损伤[4,5]。尽管上述研究已证实PM2.5对肺的急性毒性作用，但目前尚未完全阐明PM2.5导致肺损伤效应及其致病机制。

氧化应激是机体氧化与抗氧化系统失衡而导致的机体应激状态，其产生的活性氧能引发脂质过氧化作用，造成线粒体、内质网等细胞器结构和功能异常，并可促发炎症反应，最终导致组织损伤。氧化应激及其所致的细胞器功能异常是否参与了PM2.5所致肺损伤目前尚不清楚。另外，不同地区PM2.5的化学组成差异对肺组织的毒性影响也不同[6]。因此，本研究拟从杭州市中心城区采集秋冬季节的PM2.5颗粒物，通过建立气管滴注模型，探讨杭州市中心城区PM2.5急性染毒对大鼠肺部的损伤作用，主要关注PM2.5所致肺氧化损伤、炎症反应和对内质网应激的影响。本研究有望为PM2.5暴露所致肺损伤的毒理学效应提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

KC1000型大气颗粒物采样器(青岛崂山电子仪器总厂有限公司)，石英纤维滤膜(PALL Life Sciences，美国)，IX70型倒置显微镜(Olympus，日本)，电子分析天平(梅特勒-托利多，瑞士)，酶标仪(Molecular Devices，美国)，真空冷冻干燥仪(Labconco，美国)，高速台式冷冻离心机(Hermle，德国)。电泳仪、转膜仪及凝胶成像分析系统 (Bio-Rad，美国)。

TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA试剂盒和ECL化学发光检测试剂盒 (杭州联科生物技术有限公司)，RIPA裂解液 (上海碧云天生物试剂有限公司)，兔抗大鼠GRP78/94抗体、兔抗大鼠CHOP抗体、兔抗大鼠PERK抗体、兔抗大鼠p-PERK抗体、兔抗大鼠eIF2α抗体、兔抗大鼠p-eIF2α抗体、兔抗大鼠IRE1α抗体、兔抗大鼠XBP1抗体和小鼠抗大鼠β-actin抗体(Cell Signaling，美国)，PVDF膜(Millipore，美国)。

1.2 PM2.5颗粒的收集与准备

2015年9月至2016年12月，在杭州市区采用KC1000型大气颗粒物采样器将PM2.5颗粒采集于石英纤维滤膜上。6 d采样一次，每次采样持续24 h，采样流量为1.05 m3/min。

将载有PM2.5的滤膜剪成1 cm×1 cm大小，浸入超纯水中，超声处理30 min×3次洗脱PM2.5。洗脱液经6层纱布过滤并置于-80 ℃低温冰箱过夜后，冷冻干燥使水分完全蒸发得到干燥黑色絮状物。称重，染毒前以生理盐水配制成10 mg/ml悬液，超声振荡15 min并灭菌后备用。

1.3 实验动物处理

将24只SPF级雄性SD大鼠(150 g～180 g) (购自浙江省医学科学院实验动物中心，许可证号：SCXK(浙)2014-0001)随机分为3组：对照组，PM2.5低剂量组和PM2.5高剂量组(n=8)。PM2.5低剂量组 (Low dose PM2.5 group) 和PM2.5高剂量组 (High dose PM2.5 group) 以气管滴注的方式进行PM2.5染毒，滴注体积为1 ml/kg BW，染毒剂量分别为5 mg/kg BW和25 mg/kg BW，对照组(Control)给予等体积生理盐水，每周1次，连续染毒暴露4周。

1.4 HE染色

大鼠用水合氯醛 (300 mg/kg) 麻醉后，腹主动脉放血处死，暴露气管和肺。剪取部分左肺，经4%多聚甲醛固定2 h，流水冲洗过夜，梯度乙醇 (70%，80%，90%，95%和100%) 处理、石蜡包埋并连续切片，切片厚度为5 μm。石蜡切片经二甲苯脱蜡后行HE染色，置IX70显微镜下观察肺组织形态学改变。

1.5 支气管肺泡灌洗液的提取

分离出颈部气管后，将灌洗针头插入气管、结扎固定，并以止血钳夹闭左侧主支气管。用3 ml预冷的PBS灌洗肺部3次，回收量>50%，将收集到的支气管肺泡灌洗液 (bronchoalveolar lavage fluid，BALF) 置于4℃冰箱保存[7]。

1.6 总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脱氢酶(LDH)释放的检测

BALF经1 500 r/min离心10 min后，收集上清液。采用南京建成生物工程研究所试剂盒，严格按照试剂盒说明书测定BALF中总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脱氢酶(LDH)活性。

1.7 ELISA法检测炎性因子释放

BALF经1 500 r/min离心10 min后，收集上清液。在96孔板中，每孔加入50 μl上清液，严格按照TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA试剂盒操作说明书，检测BALF中上述炎性因子含量的变化。

1.8 肺组织蛋白质提取及Western blot

大鼠处死操作同1.4。剪取部分未经灌洗的左肺，称重后按每20 mg组织加入200 μl的比例加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min离心15 min后收集上清液。BCA法检测各组大鼠总蛋白浓度后，加入上样缓冲液并煮沸10 min。冷却后每孔上样50 μg蛋白质，作总胶浓度12%的SDS-PAGE。电泳后将蛋白质转移至PVDF膜上，经5%脱脂牛奶常温封闭1 h，分别加入兔抗大鼠PERK抗体、兔抗大鼠p-PERK抗体和兔抗大鼠eIF2α抗体，4 ℃孵育过夜。次日用TBST洗涤3次，加入HRP标记的二抗室温孵育2 h，TBST清洗3次后加入ECL显色液；凝胶成像系统扫描分析各蛋白质表达的变化。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 PM2.5染毒对大鼠肺组织外观的影响

如图1所示，空白对照组大鼠肺呈粉红色，表面光滑，触之弹性较好；低剂量PM2.5染毒组大鼠肺表面基本光滑，肉眼可见有少量出血；高剂量PM2.5染毒组大鼠肺表面塌陷、多褶皱，弹性差，出血点较多。上述三组大鼠肺外观的区别表明： PM2.5染毒能导致大鼠肺产生病变(图1见彩图页Ⅳ)。

2.2 PM2.5染毒对大鼠肺组织形态学的影响

光镜下，空白对照组大鼠肺泡结构基本完整，肺泡壁正常，肺泡隔增厚，但肺泡腔内无明显淋巴细胞浸润(图2A)；低剂量和高剂量PM2.5染毒组大鼠肺组织均可见明显的炎症改变，表现为部分肺泡萎缩或消失、肺泡壁增厚，肺组织内淋巴细胞数量增多且浸润明显(图2B，2C，见彩图页Ⅳ)。

2.3 PM2.5染毒对大鼠炎性因子表达的影响

与空白对照组比较，低剂量和高剂量PM2.5染毒组大鼠BALF中的TNF-α、IL-1β和IL-6水平均显著上升，高剂量组上述指标分别升至空白对照组的1.27倍、2.27倍和1.22倍(表1，P<0.05)，提示PM2.5染毒可诱导大鼠肺部的炎症反应，且低剂量与高剂量PM2.5染毒组大鼠BALF中的TNF-α和IL-1β水平也存在显著差异(表1，P<0.01)。

GroupTNF-αIL-1βIL-6 Control56.89±4.88144.12±14.1526.94±4.04Low dose PM2.565.50±5.85*267.30±27.10*34.22±4.94*High dose PM2.572.40±6.01**#327.54±40.91*#37.80±5.71*

Control group: Intratracheal instillation of 1 ml/kg BW saline; Low dose PM2.5 group: Intratracheal instillation of 5 mg/kg BW PM2.5; High dose PM2.5 group: Intratracheal instillation of 25 mg/kg BW PM2.5; TNF-α: Tumor necrosis factor-alpha; IL-1β: Interleukin-1 beta; IL-6: Interleukin-6

*P<0.05,##P<0.01vscontrol group;#P<0.05vslow dose PM2.5 group

2.4 PM2.5染毒对大鼠T-AOC含量、SOD和LDH活性的影响

与空白对照组比较，低剂量和高剂量PM2.5染毒组大鼠BALF中T-AOC含量和SOD活性明显下降，低剂量组大鼠分别降至空白对照组的69.41%和70.83%，高剂量组大鼠分别降至空白对照组的60%和50% (P<0.05，表2)；而低剂量和高剂量PM2.5染毒组大鼠BALF中的LDH活性则呈剂量依赖性上升，其LDH活性分别上升至空白对照组的2.05倍和2.83倍(P<0.05，表2)，且低剂量与高剂量PM2.5染毒组之间也存在显著差异(P<0.05，表2)。

GroupT-AOC(mmol/ml)LDH(mmol/L)SOD (U/ml) Control1.70±0.14251.00±14.530.24±0.09Low dose PM2.51.18±0.20*516.75±39.24*0.17±0.02*High dose PM2.51.02±0.10*710.88±82.43*#0.12±0.01*

Control group: Intratracheal instillation of 1 ml/kg BW saline; Low dose PM2.5 group: Intratracheal instillation of 5 mg/kg PM2.5 ; High dose PM2.5 group: Intratracheal instillation of 25 mg/kg BW PM2.5; T-AOC: Total antioxidant capacity; SOD: Superoxide dismutase; LDH: Lactic dehydrogenase

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vslow dose PM2.5 group

2.5 PM2.5染毒对大鼠肺组织内质网信号通路活化检测

Western blot结果显示，高剂量PM2.5染毒组大鼠肺组织发生内质网应激反应，其PERK/eIF2α和IRE1α信号通路均被激活。具体表现为与空白对照组比较，高剂量PM2.5组大鼠肺组织中内质网应激通路蛋白GRP78、p-PERK、p-eIF2α和CHOP蛋白质水平均显著增加，PERK和eIF2α蛋白质水平则几乎不变(图3)；同时，高剂量PM2.5染毒组大鼠肺组织中IRE1α和XBP1-S的水平也显著增加，而XBP1-U的水平则明显下降(图3)。

3 讨论

流行病学和动物实验均证实，PM2.5与多种呼吸系统疾病密切相关，且PM2.5引发呼吸系统损伤的程度随着地区和季节的不同存在很大差别[8]。本研究初步探寻了杭州市中心城区秋冬季PM2.5急性暴露引起的大鼠肺部损伤特征及可能的调控机制。

一般认为，炎症反应引起的肺组织损伤是PM2.5引发肺部疾病的主要原因之一。既往研究表明，PM2.5染毒能诱导大鼠或小鼠肺组织出现明显的炎性渗出，肺组织匀浆和BALF中的炎性因子IL-6和TNF-α水平显著上升[4]。本研究也证实，大鼠经PM2.5连续染毒4周后，其肺组织出现明显的炎症改变(图1，图2)，其BALF中的TNF-α、IL-1β和IL-6水平均显著上升(表1)。上述实验结果证实，杭州市中心城区的PM2.5暴露能刺激肺部炎症的发生，而连续染毒将进一步造成肺部持续性的慢性炎症损伤。另一方面，外源性环境毒性物质还能打破肺部氧化/抗氧化平衡，使得肺组织内自由基、ROS过度蓄积和超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化酶活性下降，引发氧化应激[9]。肺部发生的氧化应激不但可以直接损伤气道上皮和肺组织[10]，造成肺部细胞膜通透性增加或细胞死亡溶解并大量释放细胞质酶LDH[11]，还能放大炎症反应，加剧脏器损伤，形成恶性循环[12]。本研究发现，PM2.5染毒组大鼠BALF中T-AOC含量和SOD活性下降，LDH活性显著上升(表2)，提示PM2.5造成肺组织显著的氧化损伤。由此我们推测，PM2.5可能通过氧化应激引发和放大肺部的炎症反应。

Fig.3The expression of ER stress pathway proteins in rat lung in different groups

*P<0.05vscontrol group

另有研究证实，氧化应激不但能启动和加剧炎症反应，还能造成细胞内生物大分子和细胞器(如内质网)的不可逆损伤[13,14]。内质网负责细胞内蛋白质合成、修饰和折叠组装，是氧化应激的重要靶细胞器：缺氧和自由基侵袭等刺激会导致胞内蛋白质错误折叠或未折叠蛋白质蓄积并引发内质网应激(ER stress，ERS)状态[15]。ERS可激活PERK/eIF2α、IRE1α和活化转录因子6 (activating transcription factor 6，ATF6) 介导的三条信号通路来启动未折叠蛋白反应，恢复细胞内稳态[16]。Kim等报道，香烟烟雾主要成分之一的重金属镉能诱导内质网功能紊乱并同时激活支气管上皮细胞内ERS反应和炎症反应[17]；呼吸道合胞病毒感染也能诱导小鼠肺组织活性氧含量上升、PERK蛋白质磷酸化并激活ATF6，并最终触发ERS和炎症反应[18]。本研究结果表明，PM2.5染毒能上调大鼠肺组织内的ERS标志蛋白GRP78蛋白质水平、激活PERK和IRE1α介导的ERS通路：包括PERK、eIF2-α和IRE1α的磷酸化以及XBP1的剪切(图3)。上述结果提示，PM2.5等环境毒性物质在肺部损伤过程中能激活ERS的三条信号通路，其通路应答差异可能是由于毒性物质种类不同而造成的。此外，如果上述环境毒性物质诱导的ERS持续时间过长或应激反应过度，还可能与氧化应激、炎症产生协同作用，导致细胞死亡[19]；而ERS与氧化应激和炎症的作用不是单向的，炎症因子和氧化应激也可进一步激活ERS，造成肺纤维化敏感度上升等更大的肺部损伤[18,20]。因此，对于ERS是否通过与氧化应激、炎症反应的协同作用加剧PM2.5所致肺部损伤，尚需进行更深入的探讨。

综上，杭州市中心城区的PM2.5可引起大鼠肺部持续的炎症反应和氧化损伤，并导致肺组织细胞发生ERS，推进PM2.5所致的肺损伤过程。