Necrostatin-1对小鼠脑外伤脑组织损害及行为学能力的影响

王尧淇 常盼 吴娟 陈溪萍 陶陆阳

除凋亡(apoptosis)和坏死(Necrosis)两种经典细胞死亡模式以外，很多学者研究表明在脑外伤或脑卒中的病理生理发生和发展过程中仍有其它的细胞死亡形式参与其中，如胀亡(oncosis)、自噬性死亡(autoschizis)、非凋亡性程序性细胞死亡(paraptosis)等[1]。脑外伤(traumatic brain injury，TBI)除外力直接作用导致脑实质挫伤、出血、水肿等直接原发损伤外，还有涉及多种分子生物效应如神经元和神经胶质细胞的死亡、代谢、修复过程等。近年来，关于细胞死亡过程信号转导调控也成为中枢性神经系统损伤和疾病研究的热点之一，对于探讨减少神经细胞死亡和改善神经功能障碍的治疗靶点具有重要意义。

研究发现，与程序性坏死密切相关的受体相关蛋白RIP-1能够被Necrostatin-1(Nec-1)充分抑制，分子量为259.3，分子式为5-(Indol-3-ylmethyl)-(2-thio-3-methyl)hydantoin。You等使用Nec-1证明程序性坏死也是TBI诱发的细胞死亡的重要方式之一，除了先前发现的凋亡和自噬性细胞死亡外，在脑外伤后引起的程序性细胞死亡过程还包括程序性坏死(programmed necroptotic cell death,Necroptosis)[2]。我们已进行的研究表明，Nec-1除了能够抑制脑外伤引起程序性坏死外，还可以进一步抑制自噬，从而揭示TBI诱导的不同细胞死亡方式可以存在一种“串话”机制，共同影响脑外伤的预后[3]。本研究利用形态学与行为学实验方法，探讨程序性坏死特异性抑制剂在脑外伤引起的小鼠组织缺损和行为能力(运动功能和学习能力)障碍中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

成年健康昆明小鼠，体重在25 g左右，共72只，随机分为假手术(Sham)组，脑外伤+二甲基亚砜(DMSO)组，脑外伤+Nec-1(Nec-1)组，每组各24只。

1.2 药物与试剂

Necrostatin-1(Nec-1,Sigma-Aldrich 公司)；二甲基亚砜[DMSO，生工生物工程(上海)股份有限公司]；4%水合氯醛[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

1.3 仪器

电子精密天平(AL104)，Mettler-Toledo公司；立体定位仪，美国Kopp’s公司；自动颅骨钻，韩国Precision 公司；冰冻切片机，德国LEICA公司；光电子VI-470 CCD相机，美国Ludl Electronic Product公司；水迷宫，上海移数信息科技有限公司；自由落体打击器，自制；爬杆工具，自制。

1.4 方法

1.4.1 小鼠定量脑外伤模型建立及分组

称取小鼠重量，筛选使用25 g左右的成年健康小鼠，经腹腔注射4%水合氯醛(1 ml/100 g)麻醉，利用立体定位仪，将小鼠头部固定好，充分剪毛，尽量暴露头皮，用70%已用酒精消毒，手术刀取头皮正中切口，长2.0 cm，右侧头颅骨膜采取顿性方法剥离，在头部冠状缝后、中线旁各1.0 mm位置用圆形钻头骨钻锯开一直径5.0 mm骨窗，显露硬脑膜，确保硬脑膜完整；拥有压力传感记录仪、支座、引导杆、自由落体和液传导撞筒等部分组装成为改良的自由落体打击脑外伤制模装置；使用2个活塞封闭撞筒两端，中空润滑油润滑，压力传感器通过侧管连接；压深调控杆和等张弹簧位于顶部活塞和撞筒之间，半径2 mm的冲击杆设置在底部活塞内侧；当引导杆引导落体下降，撞击上活塞，压深调控杆可以让上下活塞在设置范围里移动，硬膜及脑组织被冲击杆撞击，撞击时间和撞筒内压，在撞击时记录；自由落体打击器由支座、引导杆、砝码、等张弹簧、液体传导撞筒、压力传感记录仪和冲击杆等部分组成；撞筒上下端被2个活塞封闭，中间装有润滑油，通过侧管接压力传感器；按照文献[4]报道的方法，落体使用40 g砝码，下落高度为20 cm，控制以金属圆柱下降<2 mm，进行小鼠脑外伤造模，逐层消毒以预防创口感染，缝合头皮。

DMSO 1 μL溶解配制成为Necrostatin-1(Nec-1，2.6 μg/μL)使用液，右侧侧脑室打击前15 min注射，分组成为Nec-1组；溶剂DMSO 1 μL，打击前15 min右侧侧脑室注射的小鼠，为DMSO组；假手术组(Sham组)仅切开头皮、右顶部开骨窗，不致脑外伤。

1.4.2 爬杆试验和水迷宫定位航行试验

每组小鼠各15只，脑外伤后24 h开始进行爬杆试验，进行7 d，然后进行水迷宫试验；进行爬杆试验时用手将小鼠的尾巴轻轻拎起，让小鼠2个前爪抓住立柱间铁丝线的中部，从前、左、右3个方向使每只小鼠重复操作3次，评分方法根据表1，取平均分。

表1 爬杆试验评分标准

Morris水迷宫检测系统包括一部图像全自动采编处理系统(包括摄像机、录像机、显示器和分析软件等)，1个大的盛有染料水的圆形水桶和供小鼠站立的平台隐藏在水面下；水桶的高度为0.5 m，半径0.6 m，平台高度为0.3 m、直径为15 cm，碳粉作为染料加入水内混合充分，调整水温25 ℃左右，平台位于水下，小鼠无法在行为学训练过程中看到；将4个标记点在水桶内壁等距离设置，圆形水面便形成四个象限，第3象限的中央放置平台，位于水面下1.5 cm；小鼠头朝向桶壁分别在各象限放入水中，让小鼠随机游泳，在120 s内未搜寻到平台，并站在台上小鼠，可将小鼠牵拉到平台上站立，训练后小鼠要求能够在平台停留20 s以上，而后在进行下一次训练；考察小鼠学习能力，必须进行数天时间的定位航行试验(place navigation)，小鼠搜寻平台的潜伏期进行记录，用于评价。

外伤后第8 d小鼠开始第1次水迷宫实验，每日进行1次，小鼠每次随机选择象限进入水中，并连续完成4个象限，连续7 d小鼠接受训练，寻找水下平台，并将小鼠找到平台的时间(逃避潜伏期)记录，后续2 d，将平台显露在水面以上，让平台在小鼠可视情形下进行测试。

1.4.3 脑组织缺损体积测量

选取Sham组、DMSO组和NEC-1组小鼠各9只；脑外伤后21 d，麻醉断头，解剖取出全脑，利用液氮将脑组织迅速冰冻15 s，然后再利用冰冻切片机进行切片，各组选择一致断面(切片厚度选择12 μm，每个断面250 μm，分为8个断面)，苏木精染色；等倍放大切片，使用VI-470 CCD光电子相机进行图像采集，采集图像后提取脑组织缺损区，将电子图像导入电脑后利用Image-Pro Solution图像处理软件，测量未手术侧皮质总的面积，Cavalieri方法确定损伤皮质体积占整个皮质体积的比例，计算公式脑组织损伤体积(%)=(健侧体积-损伤侧体积)/健侧体积×100%。

1.4.4 统计学处理

试验数据使用SPSS17.0统计软件进行统计学分析和t检验。以P<0.05为存在统计学差异。

2 结 果

2.1 爬杆试验

脑外伤后1 d DMSO组小鼠爬杆试验评分较Sham组明显降低(P<0.01)，伤后2～7 d评分回升，Nec-1侧脑室预给药可加快小鼠脑外伤后运动能力的恢复过程(P<0.05)(图1)。

图1 脑外伤后1～7 d各组爬杆试验得分 与DMSO组比较,#P<0.01,*P<0.05

2.2 水迷宫试验

小鼠脑外伤后第9～14 d DMSO组与Sham组比较，寻找平台潜伏期更长(P<0.05)；与DMSO组比较，Nec-1组在脑外伤后第9～12 d搜寻平台表现为更短的潜伏期(P<0.05) (图2)。

图2 脑外伤后8～16 d各组水迷宫定位航行潜伏期 与DMSO组比较,#P<0.05,*P<0.05

2.3 脑组织缺损体积测量

脑外伤后21 d DMSO组小鼠与sham组小鼠比较明显可以见到部分脑组织缺损(P<0.01)，然而与DMSO组比较，Nec-1预处理能显著减小脑外伤后脑组织缺损体积(P<0.05)(图3)。

图3 各组小鼠脑外伤后21 d脑组织缺损体积 与DMSO组比较,#P<0.01,*P<0.05

3 讨 论

大量报道表明，脑外伤(TBI)除了可以造成脑组织直接破坏、神经细胞非程序性坏死外，还可以通过诱导神经元凋亡，触发细胞死亡信号转导，调控自噬或者程序性坏死等途径，诱发神经细胞程序性死亡，进一步影响脑外伤后神经功能转归。研究证实，参与脑外伤后神经细胞损伤的病理机制主要涉及线粒体损伤及功能障碍、氧自由基产生、半胱天冬氨酸酶(caspases)系统激活、继发性兴奋性氨基酸受体激活、炎症反应和内皮细胞功能紊乱等[5]。我们之前的研究已经发现，多种程序性细胞死亡方式参与了脑外伤后的信号调控且可以进一步影响脑外伤后的脑组织修复和神经功能恢复[6-7]。因此，研究脑外伤造成的神经细胞死亡必须考虑多种细胞信号转导机制，而细胞死亡方式调控的研究也已经成为脑外伤的研究热点之一，如果可以发现针对脑外伤后引起的多种生物信号的综合干预手段，则有望形成更加完善的脑外伤综合治疗方案，对研究改善脑外伤后神经功能障碍具有重要意义。

近年来，学者发现坏死一定条件下也是可以受细胞信号调节的死亡方式，并非绝对消极的细胞死亡过程[8]。当caspase-8活性减弱就无法完全分解受体交互作用蛋白-1(RIP1)和受体交互作用蛋白-3(RIP3)，后者聚集而成的复合体能够互相磷酸化彼此的死亡结构域，形成激活型RIP3，将细胞坏死信号向下游传递[9-10]。程序性坏死是受体介导非caspase依赖型程序性细胞死亡方式，多年研究发现，程序性坏死有以下特征：(1)组织学检验具有坏死形态特征，前期能够见到细胞膜破坏；(2)同时下游信号转导能够产生自噬；(3)线粒体膜电位消失；(4)特定情况下可出现细胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)增加；(5)能够被特异性抑制NEC-1拮抗，而凋亡抑制剂不能够影响坏死过程[11-12]。

Necrostatin-1(NEC-1)被研究中证实是一种细胞受体交互作用蛋白激酶-1(RIP-1)的特异性抑制剂，能有效抑制程序性坏死[12-13]。我们之前的研究也在小鼠脑外伤模型上证实了脑外伤可以导致神经元死亡，而且程序性坏死抑制剂Nec-1可以减少脑外伤后的神经元死亡数目，说明程序性坏死参与了脑外伤后的神经元程序性死亡过程。我们研究还进一步表明，通过抑制程序性坏死可以同时抑制脑外伤后皮质组织和海马组织中的自噬和凋亡，并且通过联合使用自噬和凋亡特异性抑制剂，我们发现在小鼠脑外伤模型上抑制自噬可以同时抑制凋亡半胱天冬氨酸酶(caspases)系统的激活，达到同时抑制凋亡的效果，而单独抑制凋亡，随着凋亡活性的抑制，可同时引起微管相关蛋白1轻链3的-II(LC3-II)表达上调，自噬活性增加[3]，这进一步说明不同程序性细胞死亡方式在小鼠TBI后的细胞程序性死亡调控中也具有潜在的“串话”机制。小鼠脑外伤后神经功能的预后与多种细胞死亡方式调控有关，本研究结果表明在我们之前已有的研究基础上又进一步证明抑制程序性坏死同样也可以减少小鼠脑外伤后脑组织损伤体积，从而有利于小鼠脑外伤后脑组织形态的修复。本实验也通过爬杆试验和Morris水迷宫试验进一步发现侧脑室Nec-1预给药可以起到改善脑外伤后运动功能和学习能力的效果。这也进一步提示程序性坏死的调控有望成为脑外伤新的治疗靶点。