Myosin 1H基因多态性与骨性下颌后缩的相关性研究

尹倩 王小琴

骨骼肌收缩依赖结构和功能完整的肌球蛋白重链异构体[5]。肌球蛋白重链(MHC)通过复杂组合形成的肌球蛋白，是肌原纤维粗丝的组成单位。肌球蛋白具有收缩调节功能,对骨骼肌纤维收缩起重要作用。研究显示, 骨骼肌的可塑性与肌球蛋白重链异构体的种类、组成及相互转化关系密切，免疫组化和基因研究发现仅咬肌纤维就表达了4种不同的肌球蛋白重链异构体[6]。对于I类肌球蛋白基因(MYO1H)，第30外显子中单核苷酸多态性可导致野生型碱基G突变为A，从而使脯氨酸与原链中第1001位的亮氨酸发生置换。单核苷酸多态性是指DNA序列中由于单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性。SNPs广泛存在于基因组中，是一种稳定遗传的早期病变，与疾病相关[7]。它是继限制性片断长度多态性、简单重复序列之后的第3代分子遗传标记。其中MYO1H的rs3825393多态位点被报道与南亚人群MR发生显著相关[8]，由于东、南亚人群存在地域和种族差异,因此本实验以国内山西太原地区人群为研究对象，对MYO1H rs3825393多态位点与该疾病的相互关系及影响进行探讨。

1 资料与方法

1.1 病例选择

对照组：①Ⅰ类骨面型，磨牙中性关系；②头颅侧位片颅底角=127.3°±3.8°，下颌角=119.8°±5.6°、后前面高比=0.65±0.04、上下颌大小形态正常：∠SNA=78°～86°，∠SNB=76°～84°，∠ANB=2°～ 4°。

1.2 研究方法

1.2.1 样本收集和DNA提取 知情同意后，分别抽取空腹肘静脉血液样本3 ml，EDTA抗凝处理。使用DNA Blood Mini kit(OMEGA)试剂盒并根据使用说明提取两组患者全基因组DNA，-4 ℃保存。

1.2.2 MYO1H rs3825393多态位点目的基因扩增应用Premier 5软件设计引物，序列为F5’-GGCTTACTTCCCTCCCAGAG-3’，R5’-CTGTGGCAACAGCATTCTTC-3’(Invitrogen合成)。使用聚合酶链法扩增DNA样本内目标序列，PCR反应体系：DNA模板50～100 ng，2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μl(TransGen，中国)，上下游引物各1 μl(10 pmol/L)，无菌去离子水补足总体积至25 μl，混匀。PCR扩增条件：95 ℃ 预变性2 min，循环条件94 ℃ 1 min，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 个循环。扩增产物经电泳分析证实PCR扩增成功。取PCR产物5 μl，经1.5%琼脂糖凝胶电泳，以DI 2000 DNA marker为分子量标准品，电泳完毕后用凝胶成像分析系统照相并保存。

1.2.3 酶切和多态性检测 取纯化后的PCR产物10 μl加入总体积25 μl的酶切反应体系中，体系内还有：2U Sau96I内切酶(BioLabs，America), 2 μl酶切缓冲液，无菌去离子水补至25 μl，37 ℃水浴2 h。酶切片段在1.5%琼脂糖凝胶上以120 V电压电泳30 min，结束后于紫外灯下根据酶切图谱判断基因型。具体酶切位点为5’…GG(N) CC…3’和3’…CC(N) GG…5’。

1.3 统计学分析

分析2 组基因型分布是否符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。基因型、等位基因分布及其与易感性的关系采用SPSS 21.0统计软件包处理，采用χ2检验比较2 组在基因型和等位基因分布上是否存在统计学差异。

2 结 果

2.1 2 组患者基线资料及头影测量值比较

病例组和对照组性别、年龄比较差异无显著性(P>0. 05)(表 1)；SNB、ANB角在2 组间有显著差异，其余测量值在2 组间均相似，证明所选MR患者及对照者符合诊断及纳入标准，具有代表性(表 2)。

表 1 2 组患者基线资料

表 2 基因型间头影测量值比较

2.2 Hardy-Weinberg平衡检验

2 组MYO1H rs3825393位点基因型分布经 Pearsonχ2检验均符合 Hardy-Weinberg平衡，具有代表性(表 3)。

表 3 对照组与病例组遗传平衡性检测结果

2.3 目的基因扩增和酶切分析

目的基因扩增片段长度为302bp(图 1)，Sau96I酶切后，野生GG型(76bp和226bp)者为2 条电泳带；G→A突变后产生一个酶切位点，杂合突变AG型(76bp，226bp，302bp)者为3 条电泳带；纯合突变AA型(302bp)者只有1 条电泳带(图 1～2)。

图 1 MYO1H基因rs3825393位点扩增电泳图

图 2 MYO1H基因rs3825393位点产物经限制性内切酶Sau96I酶切后的电泳图

2.4 MYO1H rs3825393位点基因型及等位基因频率比较

本实验中GG型共35 例，其中对照组24 例，病例组11 例；AG型37 例：对照组13 例，病例组24 例；AA型8 例：对照组3 例，病例组5 例。3 种基因型在对照组中分布分别为60%、 33%、7%，在病例组中分别为27%、60%、13%，2 组间基因型分布差异有显著性(表 4)。等位基因G、A在对照组中数量、占比分别为61(76.2%)、19(23.8%)，在病例组中数量、占比分别为46(57.5%)、34(42.5%)，分布在2 组间有显著性差异(表 5)。

表 4 2 组患者MYO1H rs3825393位点基因型分布 (%)

Tab 4 The distribution of MYO1H rs3825393 target genotype in the 2 groups (%)

注： ①GG/AG/AA 2 组间基因型分布差异有显著性

表 5 2 组患者MYO1H rs3825393位点等位基因分布(%)

注： ①G型和A型等位基因频率2 组间差异有显著性

2.5 多因素分析

采用Logistic回归法分析年龄、性别及MYO1H多态性与MR易感性的关系，结果显示整个回归模型具有统计学意义，MR与基因型有相关性(P<0.05)；与年龄、性别无相关性(P>0.05)(表 6)。

表 6 多因素分析结果

注：χ2=10.373，P=0.035

3 讨 论

MR是一类发育性疾病，病因包括环境、遗传及二者相互作用。研究显示环境因素对MR起一定作用：局部因素如不良习惯,替牙障碍，肌平衡失调等；全身疾病如佝偻病，炎症如中耳炎等会影响髁突及下颌骨发育；下颌骨及髁突外伤也会造成下颌骨发育障碍。

Richards等[8]对MR患者和下颌正常者进行了MYO1H SNP分析，通过比较第30外显子间的差异，发现rs3825393多态位点增加了MR的风险。

在本实验凝胶电泳图中，对照组中有3 例出现1 个条带-302bp，代表基因型为AA纯合子；有24 例出现2 个条带-76bp，226bp，代表基因型为GG纯合子；有13 例出现三个条带-76bp，226bp，302bp，代表基因型为AG杂合子。同样，病例组中有5 例电泳结果出现一个条带，基因型为AA；11 例出现2 个条带，基因型为GG；24 例出现3 个条带，基因型为AG。而判断等位基因时，将杂合子的一半认为是等位基因G，另一半认为是等位基因A。经χ检验，2 组间等位基因和基因型分布差异均有显著性。病例组中AG基因型数量明显高于其他两型，A等位基因的携带频率明显高于对照组，说明国内汉族骨性MR人群在MYO1H rs3825393多态位点处由G突变为A占很高的比例，携带AG、AA基因型的人群增加了MR的发病风险。

本研究首次报道国内汉族人群MYO1H rs3825393多态位点与MR的相关性，但目前MR的致病机制尚处于初步探索阶段，不可否认遗传因素在其发病中占重要地位，MYO1H 也与下颌骨发育关系密切。本实验只对该基因的一个SNP位点进行了探究，并未探讨该基因启动子、内含子及编码区的其余多态位点，因此不能排除其他突变与MR存在作用的可能性。本研究在样本量及地域方面存在一定局限性， 下一步拟采用基因测序方法对酶切结果进行验证。同时该疾病也与环境因素有关，拟后期行多因素分析。

(收稿： 2017-12-14

修回： 2018-02-03)